4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

要約

Stemgent Doxの誘導性マウスTFのレンチセットは、人工多能性幹（iPS）細胞に、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）を再プログラムすることができます。ここでは、マウスプログラミング転​​写因子Oct4のDOX誘導性発現のためのプロトコルを示す、レトロウイルスベクター、KLF4およびc - Mycが発現する共通のMES多分化能マーカーのiPSコロニーを生成する。

要約

転写因子と細胞培養条件の定義セットを使用して、山中らは、レトロウイルス媒介送達および発現Oct4の、レトロウイルスベクター、c - Mycの、とKLF4がマウスの線維芽細胞における多能性誘導できることを実証した¹以後のレポートは、ユーティリティを実証したドキシサイクリンの（DOX）他の大人のマウスの体細胞型のさまざまなプライマリおよびセカンダリの両方のiPS細胞の生成にレンチウイルスの配信システム誘導性^。2,3

人工多能性幹（iPS）細胞は、形態、増殖と奇形腫の形成を誘導する能力の胚性幹（ES）細胞に類似しています。細胞の両方のタイプは、再生医療において、分化細胞または組織の世代のための多能性出発原料として使用することができます^。4-6 iPS細胞は、それらがの倫理的ジレンマなしでES細胞の主要な特性を示すとしても、ES細胞上の明確な利点を持っている胚の破壊。

ここではStemgent DOX誘導性マウスTFレンチセットで、マウス胚性線維芽細胞（MEF）細胞を再プログラミングするためのプロトコルを示す。我々はまた、Stemgent DOX誘導性マウスTFのレンチセットは、それによってES細胞の特徴的な多分化能マーカーを表示する多能性幹細胞の状態を誘導するのMEFに伝達時に4つの転写因子のそれぞれを発現可能であることを示している。

プロトコル

1。 MEFのウイルスの伝達

0.2％、実験を始める前日、コート15cmの細胞培養皿ゼラチン滅菌 ₂ O. 37℃で一晩インキュベートする℃、5％CO ₂。
1. 4 × 10の濃度で、ゼラチンコートしたディッシュ、そしてシードのMEF細胞（我々はNanog-GFP/rtTA MEF細胞を使用）から液体を吸引 ⁵ディッシュあたりの細胞。 MEFの増殖培地30 mlに細胞をインキュベートする（450ミリリットルDMEMは5ミリリットル100 × 50ミリリットルFBS、非必須アミノ酸、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5ミリリットルに200mM L -グルタミンし、0.5ml 55mmのβ-メルカプトエタノールを添加した）のために37℃、5％のCOで2日間 ₂約80％コンフルエントになるまで。
2. 培地を吸引除去し、濃縮されたレンチウイルス（4 ×100μlのウイルスストック溶液+ 29.6ミリリットルの増殖培地）を添加したMEFの増殖培地30 mlを加える。培地を均等に優しく料理を揺らし。 37℃で一晩細胞をインキュベート℃、5％CO ₂。

2。ドキシサイクリン誘導のリプログラミング

1. 20〜24時間後の伝達、（450ミリリットルノックアウトDMEMに50ミリリットルES細胞修飾子牛血清、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシンを添加した、5分間、200 xgで、遠心分離機を形質導入細胞をトリプシン処理し、ES / iPS細胞増殖培地に再懸濁します。 5ミリリットル200mMのL -グルタミン、0.5 mlのβ-メルカプトエタノール及び25μlのLIF）。シードは、MEFの細胞培養皿のサイズに適切な濃度で（我々は2.5 × 10を使用する形質 ^{5細胞 4 ICC実験用4ウェルプレートにウェル当たりの細胞）。 37℃、5％のCOで一晩インキュベートする ₂。注：残りの形質細胞は、将来の分析のために液体窒素で凍結することができます。}
2. 培地を吸引除去し、ES / iPS細胞培地を新鮮な準備と（我々はまた、ネガティブコントロールとしてDOXを含まない培地を追加した）濃度2μg/ mlの最終濃度にドキシサイクリンを添加したものと交換してください。 37℃、5％のCOインキュベーターで培養する ₂。

3。導入効率の免疫細胞化学的解析

48時間、免疫組織化学（ICC）によって形質導入効率を決定する。 4ウェルプレートに白い色を保ち細胞のICCのテストを行う。以下のプロトコールに記載されているすべてのボリュームは、細胞培養プレートのサイズに合わせて調整する必要があります。

1. （MGなしPBSで穏やかに細胞を1回洗浄する ^{2 +} +又はCa ^{2 +}）。
2. 室温で15分間、PBS中の0.5ミリリットルを4％パラホルムアルデヒド500μlで細胞を固定する。
3. 穏やかに2回は、PBSで細胞を洗浄。
4. PBSで氷冷0​​.2パーセントのTween ® -20の500μlを添加して細胞を透過性。室温で10分間インキュベートする。
5. 穏やかに2回は、PBSで細胞を洗浄。
6. 室温で1時間200μlのブロッキングバッファーで非特異的結合をブロック。
7. 4℃（我々はOct4のを使用、KLF4、Sox2、及びc - Mycの）で一晩、特定の一次抗体200μlで細胞をインキュベートします。
8. 穏やかに2回は、PBSで細胞を洗浄。
9. （私たちはロバ抗ウサギローダミン結合体を使用、ロバ抗ヤギ光からプレートを保護する、室温で1時間二次抗体200μlで細胞をインキュベートAlexaFluor ® 594コンジュゲート、ロバ抗マウスローダミン共役とロバ抗ウサギローダミン共役）。
10. 穏やかに2回は、PBSで細胞を洗浄。
11. DAPIを（PBSで終濃度2μg/ ml）を加え、核を可視化するために10分インキュベートする。
12. PBSで穏やかに細胞を洗浄。
13. 画像が倒立蛍光顕微鏡を使用する前に、耐フェードアクアマウントを追加。

4。 iPS細胞のコロニーを分離して拡大

1. （セクション2で説明したように）更新プロセスを開始した後、培養を監視し、48時間毎に培地交換してください。我々は最初の12日間培養細胞をするためにドキシサイクリンを含む培地を使用して、その後のiPSコロニーは、手動でDOX独立となる展開のために選んだことを保証するために培地からドキシサイクリンを除去。
2. 細胞はリプログラミング過程を示す形態学的変化について毎日モニターする必要がある、またはNanog-GFP/rtTA MEF、モニターの形態と再プログラムコロニーを同定するためにGFPの蛍光のような細胞を使用するとき。各実験は異なりますが、コロニーは16と22日間のアイソレーションのために一般的に十分な大きさです。この時間枠の間に特定されたコロニーを手動で分離し、拡張と分析のためにトリプシン処理することができます。
3. 再プログラムコロニーを分離し、トリプシン処理前日には、5 × 10の密度でγ線を照射したフィーダー層のM​​EFと播種で24ウェルプレートを準備 ⁴ウェルあたりの細胞。 37℃、5％のCOで一晩インキュベートする ₂。
4. 手動でそれぞれのiPS細胞のコロニーを選択し、細胞凝集体を解離させるトリプシン処理。 24ウェルプレートγ線を照射したフィーダー層のM​​EFで事前にシードの個々のウェルのES / iPS細胞培地に再プレートiPS細胞。ウェルズは、2 × 10の密度で接種してください ^{5細胞/。 37℃、5％のCOインキュベーターで培養する ₂。メディアを24時間ごとに変更します。}
5. 成長とGFPの蛍光のための毎日のモニターのiPSコロニー。我々は、継代前に6日間私たちの文化をインキュベートする。
6. 24ウェルプレートのウェルには一様にGFPを発現しているかを判別します。良好なGFPの発現している井戸は、γ線を照射したフィーダー層のM​​EFで事前にシードされている4ウェルプレートにトリプシン処理し、1:8継代することができます。これらのプレートは、ICCとAP染色により多能性マーカーの解析に使用することができます。

5。多能性のための免疫細胞化学的解析

私たちのICCのテストは、4ウェルプレートで展開セル上で行った。以下のプロトコールに記載されているすべてのボリュームは、細胞培養プレートのサイズに合わせて調整する必要があります。

1. （MGなしPBSで2回穏やかに細胞を洗浄 ^{2 +} +又はCa ^{2 +}）。
2. 10分間ウェルあたりPBSにTween20を氷冷0.2％0.5mlにインキュベートします。
3. PBSで細胞を穏やかに3回洗浄する。
4. 室温で1時間200μlのブロッキングバッファーで非特異的結合をブロック。
5. 一晩4特定の一次抗体200μlで細胞をインキュベート° C（我々はSSEA - 1、NanogのとOct4のを使用）。
6. 穏やかに2回は、PBSで細胞を洗浄。
7. 光（我々はロバ抗マウスローダミン共役とロバ抗ウサギローダミン結合体を使用）から遠ざけることは、室温で1時間二次抗体200μlで細胞をインキュベートする。
8. 穏やかに2回は、PBSで細胞を洗浄。
9. DAPIを（PBSで終濃度2μg/ ml）を加え、核を可視化するために10分インキュベートする。
10. PBSで穏やかに細胞を洗浄
11. 画像が倒立蛍光顕微鏡を使用する前に、耐フェードアクアマウントを追加。

6。 iPS細胞のコロニーのアルカリホスファターゼ（AP）染色

のiPSコロニーは、製造業者のプロトコルを市販のキットを利用して、次のAP活性を分析することができます。

パート7。代表的な結果

Stemgent DOX誘導性マウスTFのレンチセットは、iPS細胞にMEFのを再プログラムするために使用することができます。 MEFの伝達、転写因子の発現Oct4の後は、レトロウイルスベクター、KLF4およびc - Mycは、ドキシサイクリン（DOX +）で処理した細胞では検出することができますが、ほとんどまたは全く発現は、未処理（DOX -）細胞（図1）で検出することができます。形態学的変化は、定義されたコロニーの端と三次元成長と、より大規模でES細胞様コロニー（図2a）を生成する（この例ではDOX治療の12日間）時間の経過とともに進行します。 DOXが削除されると、いくつかのES細胞様コロニーのための細胞形態の顕著な復帰がある、しかし、コロニーの多くは、彼らのiPS形態（図2a）を維持。これらのiPS細胞コロニーは、ピックアップや継代時に、アルカリホスファターゼ（AP）、Nanogの、Oct4とSSEA - 1（図3）の典型的な多能性マーカーの発現が表示されます。多能性状態に再プログラム内在性Nanogの遺伝子座からこの実験で使用したMEF細胞の種類（Nanog-GFP/rtTA MEF細胞）GFPを発現する。 GFPの発現は、したがって、成功するリプログラミング（図3）のための予備的指標として用いることができる。

図1：免疫細胞化学（ICC）の分析48時間後のDOX誘導。一番左のパネル（- DOX）は、DOX誘導せずに4伝達因子の発現のための代表的なネガティブコントロールです。正しく表現される転写因子が核を可視化するためにDAPIで染色された対応する抗体（赤で示す）、によって確認された。

図2：形態変換。 A）3日目（D3 + DOX）から22日目（D22）に時間をかけてのiPSコロニーに圧縮し、MEFの変換を示す細胞の100倍の位相コントラストイメージングは​​。 DOXは、12日に撤回された。左上のパネル：プレート- DOXから20倍のネガティブコントロールイメージ。 B）ハイライトされた18日目後のDOX誘導のiPSコロニーの200倍の位相差とGFP蛍光画像が。 C）追加の18日目後のDOX誘導のiPSコロニーの200倍の位相差とGFP蛍光画像が。

図3：分析。 （A）、位相差顕微鏡やiPSコロニー（200倍）のAP染色。 （B）多能性マーカーの解析：左側のパネルには、レポーターの発現を再プログラミングGFPとの位相差のオーバーレイを示しています。 GFPの発現は、内因性Nanogの発現レベルを反映している。中央のパネルは、多分化能マーカーのためのICCの染色を示す。右側のパネルには、核を（100）視覚化する染色DAPIを示しています。

ディスカッション

これらの結果は、マウス胚線維芽細胞での転写因子を形質導入Stemgent DOX誘導性マウスTFのレンチセットが効率的に異所性発現を誘導することによりiPS細胞のコロニーを生成するために使用できることを示している。プログラミングの実験を設計するとき、いくつかの変数がリプログラミングの効率を最適化するために考慮されるべきである。まず、それによって標的細胞集団に統合されたウイルスの数に影響を与える、導入効率を増加または減少させる一次感染の段階でアクティブなウイルスから標的細胞の比（すなわちMOI）を変更することが可能です。第二に、細胞はDOXにさらされている時間の長さを調整すると、iPS細胞のコロニーの生成の効率に影響を与える可能性があります。活発に分裂を重ねて成長している細胞の再プログラミングに適しているとして、第三に、標的細胞の増殖能は、再プログラミング影響を及ぼす可能性があります。最後に、別のセルの番号または異なるサイズの組織培養皿のためのプロトコルを変更する際に、それが標的細胞数が培養皿の表面積に比例して調整することをお勧めします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003