التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

Summary

التصاق الصفائح الدموية في تتالي يحدث في وجود تدفق القص ، وهو عامل لا تحتسب في المقايسات التقليدية جيدا لوحة (ثابتة). هذه المقالة على تقارير الفحص الصفيحات التجميع ، وذلك باستخدام لوحة ميكروفلويديك جيدا تنسيق لمحاكاة الظروف الفسيولوجية تدفق القص.

Abstract

يحدث تراكم الصفائح الدموية في استجابة لإصابة الأوعية الدموية حيث تعرضت المصفوفة خارج الخلية تحت البطانة. التصاق الصفائح الدموية في تتالي يحدث في وجود تدفق القص ، وهو عامل لا تحتسب في المقايسات التقليدية جيدا لوحة (ثابتة). هذه المقالة على تقارير الفحص الصفيحات التجميع ، وذلك باستخدام لوحة ميكروفلويديك جيدا تنسيق لمحاكاة الظروف الفسيولوجية تدفق القص. تترسب البروتينات خارج الخلية ، والكولاجين الأول أو عامل فون ويلبراند داخل القناة ميكروفلويديك به نضح نشطة مع مضخة هوائية. ثم تغسل مع البروتينات المصفوفة العازلة وسدت لإعداد قناة ميكروفلويديك للتفاعل الصفيحات. هو الدم الكامل perfused المسمى مع صبغة الفلورسنت من خلال القناة في معدلات تدفق مختلفة من أجل تحقيق تنشيط الصفائح الدموية وتجميعها. يمكن إضافة مثبطات تكدس الصفيحات قبل تدفق التجربة الخلية لتوليد البيانات IC50 الاستجابة للجرعة.

Protocol

الجزء 1 : إعداد القنوات ميكروفلويديك لوحة BioFlux.

1. قبل تشغيل التجربة الخلية التدفق ، واحد يحتاج إلى إعداد قنوات ميكروفلويديك مع طلاء البروتين من الفائدة. في هذه الحالة ، سوف يكون استعملت الكولاجين. كل قناة لها مدخل ومخرج بئر. لهذا الطبق ، ومدخل جيد اليسار تغذية جيدة القناة والمخرج جيدا هو على حق.
2. إضعاف الكولاجين الأول (5mg/ml الأسهم) طلاء لتركيز حمض الخليك في 200μg/ml 0.02M. وسوف يحتاج المرء 20μl لكل قناة المستخدمة. مزيج لطيف من قبل triteration مع طرف micropipette.
3. إضافة 20 ميكروليتر من الطلاء على كل قناة منها لاستخدامه. يجب على المرء أن يستغني السائل الى لكمة الداخلية للمخرج التغذية جيدا قناة ميكروفلويديك من الاهتمام باستخدام micropipette. تجنب إدخال فقاعات ، لا دفع الهواء للخروج من ماصة. وتشمل قناة واحدة دون الكولاجين لمكافحة أي الكولاجين (أ السيطرة السلبية للالتصاق وتكدس).
4. إرفاق واجهة لوحة من قبل أول اصبع تشديد الخناق (4) ومرة ​​واحدة ثم هم كل مجموعة ، واستخدام برنامج تشغيل لتشديد عزم الدوران تماما. سيكون سائق عزم الدوران فوق عندما تصل إلى الحد الأقصى ضيق.
5. استخدام الوضع اليدوي في البرنامج BioFlux ، تطبيق الارواء إلى قنوات 2dyn/cm الفائدة عند ² من مأخذ جيدا. هنا لا بد من مشاهدة لكمة الداخلية مقابل أن تكون مملوءة السائل. وسوف يستغرق ذلك عدة دقائق. يمكن للمرء أن يراقب إما أن يحدث هذا الهدف باستخدام الطاقة المنخفضة على المجهر (4X) وإيجاد مدخل البئر أو من خلال عقد لوحة ويبحث في آبار مدخل من أسفل. وينبغي للمرء أن يرى لأول مرة حبة صغيرة من السائل الذي يملأ ببطء لكمة الداخلية. بمجرد ملء كمة مدخل الداخلية ، ووقف نضح في آن واحد عن طريق دفع توقف في البرنامج.
6. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
7. إزالة واجهة وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني (زائد كا ^{2 +} / ^{+ 2} ملغ) إلى منفذ بشكل جيد. بدء نضح من مأخذ جيدا في 2dyn/cm ^2. يستمر لمدة 10 دقيقة الارواء. نضح وقف وإزالة واجهة.
8. إزالة الزائدة من كلا PBS مدخل ومخرج الآبار -- أبدا إزالة السائل الذي يملأ لكمة الداخلية. كتلة القنوات باستخدام حل حجب (0.5 ٪ V / V جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني (زائد كا ^{2 +} / ^{+ 2} ملغ)). إضافة 1 مل من محلول حظر على كل منفذ جيد لاستخدامها ويروي من مأخذ جيدا في 2dyn/cm ^2. يستمر لمدة 10 دقيقة الارواء. نضح وقف وإزالة واجهة. ويمكن استخدام القنوات استعداد يصل إلى هذه الخطوة على مدار اليوم.
9. قبل إضافة الدم ، وإزالة السائل على جانبي القناة باستثناء اللكمات الداخلية.

الجزء 2. إعداد الدم مع GPIIb / الثالث ألف الأضداد المثبطة.

1. في حين أن الكولاجين هو تفرخ في القنوات ، لا بد من تحضير الدم الكامل. ينبغي للمرء أن نتبع تعليمات السلامة الإحيائية التي تمليها المعهد له / لها عند التعامل مع الدم البشري.
2. وينبغي استخدام الدم البشري الطازج (من شخص صائم) الانتباه الى تخثر سترات الصوديوم في غضون 3 ساعات من جمعها.
3. تحضير الدم عن طريق إضافة calcein 4μM AM. يعد من الأسهم 4mM calcein صباحا في DMSO وإضافة إلى الدم في التخفيف من 1 / 1000 فولت / V. مزيج لطيف من خلال انقلاب.
4. الاستغناء 1 مل من الدم calcein AM المسمى في 10 -- 1.5mL microtubes. إضافة GPIIb / الثالث ألف مثبط على كل الأضداد في التخفيف المطلوب (الوزن الجزيئي للمفتش الحكومة هو ~ 150kDa). ومثال على ذلك هو سلسلة التخفيف من 1200nM ل9nM ويتضمن الضد السيطرة والتحكم لا علاقة لها الضد. عنصر تحكم ممتازة إيجابية لتثبيط ستكون الذي يدخل (abciximab ، ايلي ليللي) في تركيز 20ug/ml. ميكس بواسطة انعكاس لطيف.
5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. مزيج لطيف من قبل انعكاس كل 10 دقائق.

الجزء 3 : تشغيل تجربة خلية تدفق على محطة العمل BF1000.

1. أولا ، لا بد من إعداد بروتوكول الآلي في وحدة التحكم BioFlux. لالكولاجين الأول ، ينبغي للمرء أن إعداد بروتوكول لتشغيل 10dyn/cm ² لمدة 10 دقائق من مأخذ جيدا. عند هذه النقطة ، ينبغي لأحد أن أيضا إعداد المعلمات الحصول على البيانات باستخدام محطة BF1000 ، بما في ذلك المناصب القناة ، في التقاط الموجة FITC والمعلومات مرور الزمن. فمن المستحسن أن القبض على 3 مجالات عرضها باستخدام هدفا لكل قناة 10X كل 30 ثانية خلال مدة 10 دقائق المجموع.
2. العمل بسرعة ، ومكان 500ul الدم أعد كل حالة استعداد إلى قنوات منفصلة. مكان لا دم السيطرة الضد الى القناة التي هي المغلفة مع الكولاجين واحد فقط التي يتم حظرها.
3. وضع لوحة على واجهة.
4. وضع لوحة على محطة العمل BF1000 المجهر. المشبك على الواجهة.
5. تنفيذ لوحة التكيف تحميل. كذلك ، نقل مرحلة واحدة تحتوي على الدم جيدا. مجموعة FTمعلمات IC التقاط الصور (زمن التعرض ، الخ... كسب).
6. في برنامج المونتاج BioFlux ، بدء لبدء تدفق اقتناء وحيازة واحد.
7. إزالة لوحة من BF1000 محطة العمل ، والتخلص من لوحة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.

الجزء 4 : النتائج الممثل.

هنا تم تقديم التصاق الصفائح الدموية للبروتوكول والتجميع في قنوات ميكروفلويديك. المعاملة مع مثبط تراكم الصفائح الدموية ، كما أدرج anti-GPIIb/IIIa في البروتوكول. الكولاجين باستخدام قنوات ميكروفلويديك المغلفة للنظام BioFlux ، ينبغي للمرء أن يتوقع أن يشهدوا تشكيل خثرة العدوانية على مر الزمن مع عينة الدم غير المعالجة ومراقبة أي تشكيل خثرة على قناة غير المصقول. في تجربة واحدة أجريت في الآونة الأخيرة ، وكان متوسط ​​حجم الركام في ظل ظروف السيطرة 2000μm ^2.
الشكل 1.

تنشيط GPIIb / الثالث ألف وسيط قوي من الصفائح الدموية للصفائح التفاعلات والاستقرار التجميع ^1. الانضمام إلى مجمع ينشط الكولاجين GPIIb / الثالث ألف لانتزاع هذا الرد ^2. بعد حضانة مع anti-GPIIb/IIIa لمدة 1 ساعة قبل التعرض القص ، وينبغي للمرء أن يتوقع أن نلاحظ انخفاضا في حجم الجلطة الدموية فضلا عن انخفاض في وتيرة تشكيل خثرة. ويمكن عادة ما تعتمد الاستجابة للجرعة يتعين مراعاتها في 10dyn/cm ^2.
الشكل 2.

كان ₅₀ IC قيمة لهذا المانع سيما في 17nM DYN 10 / سم ^2. وكان الحد الأقصى لتثبيط (لهذا المانحة) مقابل السيطرة الضد أي 11 ٪ في 10 DYN / سم ^2.

في حين عرضت هنا باستخدام أساليب محددة بروتين المصفوفة خارج الخلية ومثبط محددة من تراكم الصفائح الدموية ، والبروتوكول هو توسعة لطبقات الطلاء الأخرى ، وأنواع الخلايا الأخرى ، ومثبطات أخرى للفحوصات التصاق الخلية. المكونات الأساسية لنجاح مثل هذه التجارب هي تجنب فقاعات في القنوات ميكروفلويديك ، التخفيف الصحيح لجميع الكواشف منظفة في الصحيح ، والظروف الملائمة لاحتضان جميع الكواشف.

Discussion

في حين عرضت هنا باستخدام أساليب محددة بروتين المصفوفة خارج الخلية ومثبط محددة من تراكم الصفائح الدموية ، والبروتوكول هو توسعة لطبقات الطلاء الأخرى ، وأنواع الخلايا الأخرى ، ومثبطات أخرى للفحوصات التصاق الخلية. المكونات الأساسية لنجاح مثل هذه التجارب هي تجنب فقاعات في القنوات ميكروفلويديك ، التخفيف الصحيح لجميع الكواشف منظفة في الصحيح ، والظروف الملائمة لاحتضان جميع الكواشف.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen I, Bovine	Reagent	Invitrogen	A1064401	other sources of collagen I can be used
PBS plus Ca/Mg	Reagent	Invitrogen	14040-117
Bovine serum albumin (BSA)	Reagent	EMD Millipore	EM-2930 Bottom of Form	From VWR
calcein AM	Reagent	Invitrogen	C1430	Calcein AM from BD can also be used
BioFlux 1000 System	Reagent	Fluxion Biosciences	Contact Company
BioFlux Plate	Reagent	Fluxion Biosciences	900013
antiGPIIb/IIIa	Reagent	Abcam	ab33407	an alternative # is ab15021
ReoPro	Reagent	Eli Lilly		by Rx only