Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Resumo

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Resumo

Agregação plaquetária ocorre em resposta à lesão vascular, onde a matriz extracelular abaixo do endotélio tem sido exposto. A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento. Proteínas extracelular, colágeno I ou fator de von Willebrand são depositados dentro do canal microfluídicos com uso de perfusão ativa, com uma bomba pneumática. As proteínas da matriz são, então, lavados com buffer e bloqueados para preparar o canal microfluídicos para interações de plaquetas. Sangue total marcada com corante fluorescente é perfundido através do canal em várias taxas de fluxo, a fim de conseguir a ativação e agregação plaquetária. Inibidores da agregação plaquetária pode ser adicionada antes do experimento célula de fluxo para gerar IC50 dados de resposta de dose.

Protocolo

Parte 1: Preparação dos canais microfluídicos de uma placa BioFlux.

1. Antes de executar o experimento célula de fluxo, é preciso preparar os canais microfluídicos com uma camada de proteína de interesse. Neste caso, o colágeno I será utilizado. Cada canal tem uma entrada e uma saída bem. Para esta placa, a entrada também é a esquerda bem alimentar o canal ea saída está bem à direita.
2. Diluir o colágeno I revestimento (5mg/ml de ações) para a concentração 200μg/ml em ácido acético 0,02. Será necessário 20μl para cada canal utilizado. Misture por triteration gentil com uma ponta de micropipeta.
3. Adicionar 20 l de revestimento para cada canal respectivo para ser utilizado. Deve-se dispensar o líquido para dar um soco interior da tomada assim alimentar o canal de microfluídica de interesse usando uma micropipeta. Evitar a introdução de bolhas, não empurre o ar para fora da pipeta. Incluir um canal sem colágeno para um controle de colágeno não (controle negativo para a adesão e agregação).
4. Anexar a interface para a placa de primeiro dedo de apertar os 4 parafusos e, em seguida, uma vez que está tudo pronto, use o driver de torque para apertar completamente. O motorista torque vai clicar quando atinge a tensão máxima.
5. Usando o modo manual no software BioFlux, aplicar perfusão para os canais de interesse em 2dyn/cm ^2-o da tomada também. Aqui é preciso prestar atenção para o soco oposto interior para ser preenchido com líquido. Isso levará alguns minutos. Um pode assistir a este ocorrer a partir da objetiva de baixa potência em um microscópio (4X) e encontrar a entrada de bem ou segurando o prato e olhando para os poços de entrada de baixo. Deve-se primeiro ver uma conta minúscula de líquido que enche lentamente o soco interior. Uma vez que o soco de entrada interior está cheio, pare de perfusão de uma só vez, empurrando parar no software.
6. Incubar a placa em temperatura ambiente por uma hora.
7. Remover a interface e adicionar 1 ml de PBS (mais Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} para a saída bem. Iniciar a perfusão da tomada bem na 2dyn/cm ^2. Continue perfusão por 10 minutos. Pare de perfusão e remover a interface.
8. Retire o excesso de PBS tanto de entrada e saída de poços - nunca remover o líquido que preenche o soco interior. Bloquear os canais utilizando solução de bloqueio (0,5% v / v BSA em PBS (mais Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)).} Adicionar 1 ml de solução de bloqueio para cada saída também para ser usado e perfundir da tomada bem na 2dyn/cm ^2. Continue perfusão por 10 minutos. Pare de perfusão e remover a interface. Canais preparados até esta etapa pode ser usado durante todo o dia.
9. Antes de adicionar o sangue, remover o líquido em ambos os lados do canal, exceto para os socos interior.

Parte 2. Preparando o sangue com GPIIb / IIIa de anticorpos inibidores.

1. Enquanto que o colágeno é incubar nos canais, é preciso preparar o sangue total. Deve-se seguir as normas de biossegurança ditada por seu / sua instituto ao manipular sangue humano.
2. Sangue humano fresco (de um indivíduo em jejum), feita em anticoagulante citrato de sódio deve ser usado dentro de 3 horas após a coleta.
3. Prepare sangue adicionando calceína 4μM AM. Prepare um estoque 4mM de calceína AM em DMSO e adicionar sangue numa diluição de 1 / 1000 v / v. Misture por inversão suave.
4. Dispensar 1 ml da calceína AM rotulados de sangue em 10 - 1,5 ml microtubos. Adicionar GPIIb / IIIa anticorpo inibidor para cada na diluição desejada (o peso molecular de IgG é de ~ 150kDa). Uma série de diluição exemplo é de 1200nm para 9nM e inclui um controle de anticorpos não e um controle de anticorpos não relacionados. Um excelente controle positivo para a inibição seria ReoPro (abciximab, Eli Lilly) em uma concentração de 20ug/ml. Misture por inversão suave.
5. Incubar a temperatura ambiente por 1 hora. Misture por inversão suave a cada 10 minutos.

Parte 3: A execução do experimento de célula de fluxo na estação de trabalho BF1000.

1. Primeiro, é preciso estabelecer um protocolo automatizado no módulo de controle BioFlux. Para colágeno I, deve-se estabelecer um protocolo para executar 10dyn/cm ² para 10 minutos da tomada também. Neste ponto, deve-se também configurar os parâmetros de aquisição de dados usando a estação de trabalho BF1000, incluindo posições de canal, captura em comprimento de onda FITC e lapso de tempo da informação. Recomenda-se a captura de três campos de vista usando uma objetiva de 10x por canal a cada 30 segundos sobre uma duração de 10 minutos no total.
2. Trabalhar rapidamente lugar, 500ul de sangue preparada de cada condição em separado canais preparados. Lugar nenhum sangue controle de anticorpos em um canal que é revestido com colágeno e um que é apenas bloqueado.
3. Lugar da interface na placa.
4. Coloque a placa no microscópio workstation BF1000. Grampo na interface.
5. Executar o ajuste de carga de placa. Além disso, mover palco para um sangue bem que o contém. Set FTImagem IC parâmetros de captura (tempo de exposição, etc ... ganham).
6. No software de montagem BioFlux, iniciar a aquisição de começar o fluxo e aquisição simultaneamente.
7. Retirar a placa da estação de trabalho BF1000, dispor de placa de acordo com as diretrizes institucionais.

Parte 4: Resultados Representante.

Aqui, o protocolo de adesão e agregação plaquetária em canais microfluídicos foi apresentado. Tratamento com um inibidor da agregação plaquetária, anti-GPIIb/IIIa também foi incluído no protocolo. Usando colágeno revestido canais microfluídicos do sistema BioFlux, deve-se esperar para ver a formação de trombos agressivo ao longo do tempo com a amostra não tratada de controle de sangue e não a formação de trombos no canal sem revestimento. Em um experimento realizado recentemente, o tamanho médio de agregados em condições de controle foi 2000μm ^2.
Figura 1.

Ativado GPIIb / IIIa é potente mediador de plaquetas plaquetas interações e estabilização de agregação ^1. Adesão ao colágeno ativa o complexo GPIIb / IIIa para obter esta resposta ^2. Após a incubação com anti-GPIIb/IIIa por 1 hora antes da exposição ao cisalhamento, deve-se esperar para observar uma diminuição no tamanho dos trombos, assim como uma diminuição na freqüência de formação de trombos. Uma resposta dose-dependente geralmente pode ser observado em 10dyn/cm ^2.
Figura 2.

O IC ₅₀ valor para este inibidor específico foi 17nM a 10 dyn / cm ^2. Inibição máxima (para o doador) em relação ao controle de nenhum anticorpo foi de 11% a 10 dyn / cm ^2.

Embora os métodos aqui foram apresentados usando uma proteína da matriz extracelular específica e um inibidor específico da agregação plaquetária, o protocolo é extensível a outros revestimentos, outros tipos de células e outros inibidores para ensaios de adesão celular. Os ingredientes chave para o sucesso de tais experiências são evitar bolhas nos canais microfluídicos, diluição correta de todos os reagentes na diluentes correta, e condições de incubação adequados para todos os reagentes.

Discussão

Embora os métodos aqui foram apresentados usando uma proteína da matriz extracelular específica e um inibidor específico da agregação plaquetária, o protocolo é extensível a outros revestimentos, outros tipos de células e outros inibidores para ensaios de adesão celular. Os ingredientes chave para o sucesso de tais experiências são evitar bolhas nos canais microfluídicos, diluição correta de todos os reagentes na diluentes correta, e condições de incubação adequados para todos os reagentes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen I, Bovine	Reagent	Invitrogen	A1064401	other sources of collagen I can be used
PBS plus Ca/Mg	Reagent	Invitrogen	14040-117
Bovine serum albumin (BSA)	Reagent	EMD Millipore	EM-2930 Bottom of Form	From VWR
calcein AM	Reagent	Invitrogen	C1430	Calcein AM from BD can also be used
BioFlux 1000 System	Reagent	Fluxion Biosciences	Contact Company
BioFlux Plate	Reagent	Fluxion Biosciences	900013
antiGPIIb/IIIa	Reagent	Abcam	ab33407	an alternative # is ab15021
ReoPro	Reagent	Eli Lilly		by Rx only