Адгезии тромбоцитов и статистические Под потоком использованием микрожидкостных Клетки потока

Резюме

Тромбоцитов каскада адгезии происходит в наличии сдвигового течения, фактор не учитывается в традиционных (статических) и пластины анализов. Эта статья отчеты по агрегации тромбоцитов, анализ использования микрожидкостных хорошо пластины формата для имитации физиологических условиях сдвига потока.

Аннотация

Агрегация тромбоцитов происходит в ответ на повреждение сосудов, где внеклеточного матрикса ниже эндотелий подвергается. Тромбоцитов каскада адгезии происходит в наличии сдвигового течения, фактор не учитывается в традиционных (статических) и пластины анализов. Эта статья отчеты по агрегации тромбоцитов, анализ использования микрожидкостных хорошо пластины формата для имитации физиологических условиях сдвига потока. Внеклеточных белков, коллагена I или фактора фон Виллебранда откладываются в микрожидкостных каналов с использованием активных перфузии с пневматическим насосом. Матрица белки затем промывают буфером и заблокировали подготовить микрожидкостных канал для взаимодействия тромбоцитов. Цельная кровь помечены флуоресцентным красителем перфузии через канал при различных скоростях потока для достижения активации тромбоцитов и агрегацию. Ингибиторы агрегации тромбоцитов может быть добавлено до эксперимента проточной ячейки для получения данных IC50 дозового ответа.

протокол

Часть 1: Подготовка микрожидкостных каналов пластины BioFlux.

1. Перед запуском эксперимента проточной ячейки, необходимо подготовить микрожидкостных каналов с белком покрытие интересов. В этом случае, коллаген I будет использоваться. Каждый канал имеет вход и выход хорошо. Для этой пластинки, вход также является левым и кормления канала и выхода скважины на правом.
2. Развести коллагена I (5mg/ml акций) покрытие 200μg/ml концентрации в 0,02 М уксусной кислоты. Один будет необходимо 20 мкл для каждого канала используется. Смешать, осторожно triteration с микропипетки чаевые.
3. Добавьте 20 мкл покрытие каждого соответствующего канала будет использоваться. Надо отказаться от жидкости в к внутреннему удар розетки и кормления микрожидкостных каналов интерес использовании микропипетки. Избегайте введения пузыри, не толкать воздух из пипетки. Включите один канал без коллагена не коллагена контроля (отрицательный контроль для адгезии и агрегации).
4. Прикрепить интерфейс для пластины первый палец ужесточение 4 винта, а затем, когда они все установлены, использование крутящего момента водителю полностью затянуть. Крутящий момент водитель будет нажимать, когда он достигает максимальной герметичности.
5. Использование ручного режима в программном обеспечении BioFlux, применять перфузии на каналы проценты в 2dyn/cm ^2-от розетки хорошо. При этом необходимо следить за противоположный внутренний удар должны быть заполнены жидкостью. Это займет несколько минут. Можно либо смотреть это произойдет использованием низких целью включения микроскопа (4X) и найти вход хорошо или, держа тарелку и смотреть во входное отверстие скважины снизу. Надо сначала посмотреть, крошечный шарик жидкости, которая медленно наполняет внутренний удар. После входа внутренний удар заполнен, остановить перфузии сразу, нажав остановку в программном обеспечении.
6. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа.
7. Удалить интерфейс и добавить 1 мл PBS (плюс Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} на выходе хорошо. Начало перфузии от розетки и при 2dyn/cm ^2. Продолжить перфузии в течение 10 минут. Стоп перфузии и удалить интерфейс.
8. Удалите излишки PBS с обеих входе и выходе скважины - никогда не удалить жидкость, которая заполняет внутренний удар. Блок каналов, используя блокирующий раствор (0,5% об. / BSA в PBS (плюс Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)).} Добавить 1 мл блокирование решения каждой торговой точки также будут использоваться и заливать из розетки, а на 2dyn/cm ^2. Продолжить перфузии в течение 10 минут. Стоп перфузии и удалить интерфейс. Каналы подготовлены до этого шага могут быть использованы в течение дня.
9. Перед добавлением крови, удалить жидкость с обеих сторон канала, за исключением внутренней ударов.

Часть 2. Подготовка крови с ГП IIb / IIIa тормозных антител.

1. В то время как коллаген вынашиваются в каналы, надо готовиться цельной крови. Надо следить правил биобезопасности продиктовано его / ее института при работе с кровью человека.
2. Свежая кровь человека (от поста индивидуального) втягивается в антикоагулянта цитрата натрия следует использовать в течение 3 часов после сбора.
3. Подготовка крови, добавив 4μM кальцеин AM. Подготовка 4мм запас кальцеин AM в ДМСО и добавить в кровь в разведении от 1 / 1000 г / т. Смешать, осторожно инверсии.
4. Внесите 1 мл кальцеин AM помечены крови в 10 - 1,5 мл пробирок. Добавить ГП IIb / IIIa ингибитор антитела к каждому в нужное разбавления (молекулярный вес IgG составляет ~ 150kDa). Серия пример разведения от 1200 нм до 9nM и включает в себя не контролирует антител и связанных контроль антител. Отличные положительного контроля за торможением бы ReoPro (абциксимаба, Eli Lilly) в концентрации 20ug/ml. Mix от нежного обращения.
5. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа. Смешайте аккуратным переворачиванием каждые 10 минут.

Часть 3: Запуск эксперимента проточной ячейки на BF1000 рабочей станции.

1. Во-первых, нужно создать автоматизированный протокол в модуль управления BioFlux. Для коллагена I, следует настроить протокол для запуска 10dyn/cm ² в течение 10 минут из розетки хорошо. На данный момент, следует также установить сбор данных параметров с помощью BF1000 рабочей станции, в том числе канал позиции, захват в FITC длины волны и покадровой информации. Рекомендуется, чтобы захватить 3 поля зрения использования 10x цель каждого канала каждые 30 секунд по продолжительности 10 минут всего.
2. Рабочие быстро, место 500ul подготовленных кровь каждого условия на отдельные подготовленные каналы. Место крови нет антител управления в канал, покрытый коллагеном и тот, который просто блокируется.
3. Место интерфейс на тарелку.
4. Место пластину на BF1000 микроскопом рабочей станции. Зажим на интерфейсе.
5. Выполните язычок нагрузки. Кроме того, перемещение этапе одной скважины с кровью. Установить FTIC захвата изображения параметров (времени экспозиции, усиления и т.д ...).
6. В программное обеспечение BioFlux монтаж, запуск приобретение начать потока и приобретения одновременно.
7. Удалите пластину из BF1000 рабочей станции, распоряжаться пластины в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

Часть 4: Представитель результаты.

Вот протокол для адгезии тромбоцитов и агрегацию в микрожидкостных каналов был представлен. Лечение ингибитором агрегации тромбоцитов, anti-GPIIb/IIIa был также включен в протокол. Использование коллагена покрытием микрожидкостных каналов системы BioFlux, следует ожидать, что агрессивное образование тромбов в течение долгого времени с необработанной пробы крови контроль и не тромба на немелованной канала. В одном из недавно провели эксперимент, средний размер агрегатов под контроль условий было 2000μm ^2.
Рисунок 1.

Активированные IIb / IIIa является мощным медиатором тромбоцитов взаимодействия тромбоцитов и агрегацию стабилизации ^1. Адгезия к коллаген активизирует ГП IIb / IIIa комплекс, чтобы выявить этот ответ ^2. После инкубации с anti-GPIIb/IIIa за 1 час до сдвига экспозиции, следует ожидать наблюдать уменьшение размеров тромбов, а также снижение частоты образования тромбов. Зависимость реакции от дозы как правило, может наблюдаться при 10dyn/cm ^2.
Рисунок 2.

IC ₅₀ для данного ингибитора 17nM в 10 дин / см ^2. Максимальное торможение (для этого донора) по сравнению с контролем нет антител составил 11% при 10 дин / см ^2.

Хотя методы здесь были представлены с использованием конкретных внеклеточных белков матрицы и специфический ингибитор агрегации тромбоцитов, протокол является расширяемым, чтобы другие покрытия, другие типы клеток и других ингибиторов для анализов клеточной адгезии. Ключевые составляющие успеха подобных экспериментов являются избежание пузырей в микрожидкостных каналов, правильное разведение все реагенты в правильном разбавители, и соответствующие условия инкубации для всех реагентов.

Обсуждение

Хотя методы здесь были представлены с использованием конкретных внеклеточных белков матрицы и специфический ингибитор агрегации тромбоцитов, протокол является расширяемым, чтобы другие покрытия, другие типы клеток и других ингибиторов для анализов клеточной адгезии. Ключевые составляющие успеха подобных экспериментов являются избежание пузырей в микрожидкостных каналов, правильное разведение все реагенты в правильном разбавители, и соответствующие условия инкубации для всех реагентов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen I, Bovine	Reagent	Invitrogen	A1064401	other sources of collagen I can be used
PBS plus Ca/Mg	Reagent	Invitrogen	14040-117
Bovine serum albumin (BSA)	Reagent	EMD Millipore	EM-2930 Bottom of Form	From VWR
calcein AM	Reagent	Invitrogen	C1430	Calcein AM from BD can also be used
BioFlux 1000 System	Reagent	Fluxion Biosciences	Contact Company
BioFlux Plate	Reagent	Fluxion Biosciences	900013
antiGPIIb/IIIa	Reagent	Abcam	ab33407	an alternative # is ab15021
ReoPro	Reagent	Eli Lilly		by Rx only