Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Özet

Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları.

Özet

Trombosit agregasyonu, endotel altında ekstraselüler matriks maruz kalmışsa vasküler hasara yanıt olarak oluşur. Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları. Ekstrasellüler proteinler, kolajen I ve von Willebrand faktör pnömatik pompa ile aktif perfüzyon kullanarak mikroakışkan kanal içinde yatırılır. Matriks proteinlerine sonra tamponu ile yıkanır ve trombosit etkileşimleri mikroakışkan kanalı hazırlamak için bloke edilir. Floresan boya ile işaretlenmiş tam kan, trombosit aktivasyonu ve agregasyonu ulaşmak için çeşitli debilerde kanalı ile perfüze. Trombosit agregasyonu inhibitörleri IC50 doz yanıt veri oluşturmak için akış hücresi deney önce eklenebilir.

Protokol

Bölüm 1: BioFlux plaka mikroakışkan kanallarının hazırlanması.

1. Akış hücresi deneyi çalıştırmadan önce, bir ilgi bir protein kaplama ile mikroakışkan kanalları hazırlamak gerekiyor. Bu durumda, kollajen olacaktır. Her kanal, iyi bir giriş ve bir çıkış vardır. Bu plaka için giriş yanı sıra kanal ve sağ tarafta çıkış besleyen sol.
2. 0.02M asetik asit 200μg/ml konsantrasyonu kollajen I (5mg/ml hisse senedi) kaplama sulandırınız. Bir kullanılan her bir kanal için 20μl gerekecektir. Nazik triteration mikropipet bir ucu ile karıştırın.
3. Kullanılmak üzere her ilgili kanal kaplama 20 ul ekleyin. Bir çıkış, iyi bir mikropipet kullanarak ilgi mikroakışkan kanal beslenme iç yumruk içine sıvı dağıtmak gerekir. Kabarcıkları tanıtan kaçının, pipet hava dışarı itmek yok. Kollajen kontrolü için kollajen olmadan tek kanal (adezyon ve agregasyonu için bir negatif kontrol) ekleyin.
4. Plaka, 4 adet vida ve sonra hepsi seti bir kez tamamen sıkın tork sürücü kullanmak sıkma ilk parmak arayüzü takın. Maksimum gerginlik ulaştığında torku sürücüyü tıklatın.
5. Manuel modda BioFlux yazılım kullanarak, prize iyi ^2dyn/cm-2 kanalları ilgi perfüzyon geçerlidir. Burada bir sıvı ile dolu iç ters yumruk için dikkat etmeniz gerekir. Bu birkaç dakika sürecektir. Bir ya da bu düşük güç bir hedef, bir mikroskop kullanılarak (4X) ve iyi ya da plaka sahibi ve aşağıdan giriş kuyu içine bakarak giriş bulma meydana izleyebilirsiniz. Bir ilk olarak yavaş yavaş iç yumruk dolduran bir sıvı minik boncuk göreceksiniz. Giriş iç yumruk doldurulduktan sonra, yazılım basarak durdurmak kerede perfüzyon durdurun.
6. Plaka, bir saat oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Arayüz çıkarın ve iyi çıkış için 1 ml PBS (artı Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} ekleyin. 2dyn/cm ² iyi prizden perfüzyon başlayın. 10 dakika için perfüzyon devam edin. Perfüzyon durdurun ve arayüzü kaldırmak.
8. Giriş ve çıkış kuyuları hem de aşırı PBS Kaldır - iç yumruk doldurur sıvı kaldırmak asla. Engelleme çözümü (0.5% v / v BSA (artı Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} PBS içinde) kullanarak kanalları engelleyin. Iyi kullanılmak üzere her bir çıkış için 1 ml engelleme çözümünün ekleyin ve iyi 2dyn/cm ² prizden serpmek. 10 dakika için perfüzyon devam edin. Perfüzyon durdurun ve arayüzü kaldırmak. Bu adıma kadar hazırlanmış kanallar gün boyunca kullanılabilir.
9. Kan eklemeden önce, iç vuruşlar için dışında kanalın her iki tarafında sıvı çıkarın.

Bölüm 2. GPIIb / IIIa inhibitör antikor ile kan hazırlanması.

1. Kollajen kanalları kuluçka iken, bir tam kan hazırlamak zorundadırlar. Bir insan kanı işlerken / enstitü tarafından dikte biyogüvenlik düzenlemeleri takip etmelidir.
2. Taze insan kan sodyum sitrat antikoagülan içine çizilen (açlık kişiden), 3 saat içinde toplama kullanılmalıdır.
3. AM 4μM Calcein ekleyerek kan hazırlayın. DMSO'daki PM Calcein bir 4mm stok hazırlayın ve 1 / 1000 v / seyreltme kan davası Hafifçe çevirerek karıştırın.
4. 1.5mL mikrotüpler - 1 Calcein ml kanın 10 etiketli PM koyun. Istenilen seyreltme (IgG molekül ağırlığı ~ 150kDa) her GPIIb / IIIa inhibitörü antikor ekleyin. Bir örnek seyreltme serisi 1200nm 9nM için bir antikor kontrolü ve alakasız bir antikor kontrolü içerir. Inhibisyonu için mükemmel bir pozitif kontrol 20ug/ml bir konsantrasyonda (abciximab, Eli Lilly) ReoPro olacaktır. Hafifçe çevirerek karıştırın.
5. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Her 10 dakika hafifçe çevirerek karıştırın.

Bölüm 3: BF1000 iş istasyonunda akış hücresi deney Koşu.

1. İlk olarak, otomatik bir protokol BioFlux kontrol modülü kurmak gerekir. Kollajen için, bir 10 dakika iyi çıkış için 10dyn/cm ² çalıştırmak için bir protokol ayarlamanız gerekir. Bu noktada, bir de BF1000 iş istasyonu kullanarak veri toplama parametreleri ayarlamanız gerekir, kanal pozisyonları da dahil olmak üzere, FITC dalga boyu ve zaman atlamalı bilgileri yakalamak. 3 alandan toplam 10 dakikalık bir süre içinde kanal başına 10x amacı, her 30 saniyede bir bakış yakalamak için tavsiye edilir.
2. Her koşul için ayrı ayrı hazırlanan kanal içine hazırlanmış kan 500ul hızlı çalışarak,. Hiçbir antikor kontrol kan, kolajen ve yeni bloke ile kaplı bir kanal içine yerleştirin.
3. Arayüzü plaka üzerine yerleştirin.
4. BF1000 iş istasyonu mikroskop plaka koyun. Arayüz üzerinde Kelepçe.
5. Plaka yük ayar yapın. Ayrıca, bir de içeren kan sahne taşıyın. Set FTIC görüntü yakalama parametreleri (maruz kalma süresi, kazanç vb ...).
6. BioFlux montaj yazılımı, aynı zamanda akış ve satın alma başlamak için alımı başlatabilirsiniz.
7. BF1000 iş istasyonu plaka çıkarın, kurumsal kurallarına göre plaka atmayın.

Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları.

Burada mikroakışkan kanal trombosit adezyon ve agregasyonu için protokol sunuldu. Trombosit agregasyon inhibitörü ile tedavi, anti-GPIIb/IIIa da protokolde yer aldı. BioFlux sistemi kollajen kaplı mikroakışkan kanalları kullanarak, tedavi edilmeyen kontrol kan örneği ve kaplamasız kanal üzerinde herhangi bir trombüs oluşumu ile zamanla saldırgan trombüs oluşumu görmek için beklemek gerekir. Biri son zamanlarda yapılan deney, kontrol koşulları altında ortalama büyüklüğü agrega 2000μm ² idi.
Şekil 1.

Aktive GPIIb / IIIa trombosit-trombosit etkileşimleri ve agregasyonu stabilizasyon ¹ güçlü aracı. Kollajen yapışma bu yanıtı ortaya çıkarmak için ² GPIIb / IIIa kompleksinin harekete geçirir. Kayma maruz 1 saat önce anti-GPIIb/IIIa ile inkübasyondan sonra, bir trombüslerinin büyüklüğünde bir azalma gibi trombüs oluşumu sıklığında bir azalma gözlemlemek için beklemeliyiz. Doza bağımlı bir yanıt genellikle 10dyn/cm ² görülebilir.
Şekil 2.

Bu özel inhibitörü IC ₅₀ değeri 10 dyn / cm ² 17nM oldu. 10 dyn / cm ² Maksimum inhibisyon (Bu donör için) hiçbir antikor kontrolü ile karşılaştırıldığında% 11 idi.

Burada yöntemleri belirli bir ekstrasellüler matriks proteini ve belirli bir trombosit agregasyon inhibitörü kullanılarak sunulan iken, protokol, diğer kaplamalar, diğer hücre tipleri ve hücre adezyon deneyleri için diğer inhibitörleri genişletilebilir. Bu tür deneylerin başarısı için en önemli maddeler, tüm reaktifler için mikroakışkan kanalları, doğru seyrelticiler tüm reaktiflerin doğru seyreltme, ve uygun inkübasyon şartları ile baloncuklar kaçınma.

Tartışmalar

Burada yöntemleri belirli bir ekstrasellüler matriks proteini ve belirli bir trombosit agregasyon inhibitörü kullanılarak sunulan iken, protokol, diğer kaplamalar, diğer hücre tipleri ve hücre adezyon deneyleri için diğer inhibitörleri genişletilebilir. Bu tür deneylerin başarısı için en önemli maddeler, tüm reaktifler için mikroakışkan kanalları, doğru seyrelticiler tüm reaktiflerin doğru seyreltme, ve uygun inkübasyon şartları ile baloncuklar kaçınma.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen I, Bovine	Reagent	Invitrogen	A1064401	other sources of collagen I can be used
PBS plus Ca/Mg	Reagent	Invitrogen	14040-117
Bovine serum albumin (BSA)	Reagent	EMD Millipore	EM-2930 Bottom of Form	From VWR
calcein AM	Reagent	Invitrogen	C1430	Calcein AM from BD can also be used
BioFlux 1000 System	Reagent	Fluxion Biosciences	Contact Company
BioFlux Plate	Reagent	Fluxion Biosciences	900013
antiGPIIb/IIIa	Reagent	Abcam	ab33407	an alternative # is ab15021
ReoPro	Reagent	Eli Lilly		by Rx only