إنشاء Xenografts استئصال ورم من الدماغ داخل الجمجمة والتحليل اللاحق للنمو الورم والاستجابة للعلاج باستخدام التصوير ضوء بارد

Summary

يمكن تأسيس Luciferase معدلة وورم الدماغ البشري xenografts intracranially athymic في الفئران ، مع رصد لاحقة من نمو الورم والاستجابة للعلاج باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي. بالاشتراك مع بقاء التحليل والرصد تلألؤ بيولوجي هي أداة أساسية للبحوث ما قبل السريرية اختبار العلاجات التي يجري النظر فيها لعلاج أورام المخ.

Abstract

خدموا باستخدام نماذج زرع خلايا ورم في المخ وظيفة أساسية في بحوث علم الأورام العصبية لعدة سنوات. في الماضي ، وتألفت الإجراء الأكثر شيوعا لإنشاء الإنسان طعم أجنبي الورم من مجموعة من الخلايا من القوارير والثقافة ، وتليها الحقن تحت الجلد من خلايا الفئران التي تم جمعها في المناعة. في حين أن هذا النهج لا يزال يرى الاستخدام المتكرر في العديد من المختبرات ، كان هناك تحول كبير في التركيز على مدى السنوات العشر الماضية نحو إنشاء طعم أجنبي مثلي ، والذي ، في المقام أورام الدماغ ، ويتطلب حقن الخلايا السرطانية في الهياكل تشريحي عصبي المناسبة. لأن طعم أجنبي داخل القحف إنشاء يلغي القدرة على رصد نمو الورم من خلال القياس المباشر ، مثل استخدام الفرجار ، وتحول في التركيز نحو مثلي نماذج ورم الدماغ طعم أجنبي وقد استلزم استخدام التصوير غير الغازية لتقييم عبء الورم في الحيوانات المضيفة. من أساليب التصوير المتاحة حاليا ، ويعتبر عموما رصد تلألؤ بيولوجي لتقديم أفضل مزيج من الحساسية ، والنفعية ، والتكلفة. هنا ، سوف نظهر إجراءات إنشاء ورم الدماغ مثلي ، ورصد نمو الورم والاستجابة للعلاج عند اختبار علاجات تجريبية.

Protocol

1. ورم الخلية التحضير.

يمكن أن يكون مصدرها خلايا الإنسان xenografts ورم في المخ ، سواء من حيث معدلات نمو الأورام نشر تحت الجلد في الفئران athymic ، أو من ثقافة الخلية. وتناقش الاستفادة من كل من المصادر الخلية أدناه ، جنبا إلى جنب مع مظاهرة من طريقة لزرع الخلايا.

لتحضير الخلايا من الأورام تحت الجلد لنقلها إلى حجرة داخل القحف ، ويتم وضعها الجناح يستأصل الأورام في أطباق والثقافة ، حيث يتم في البداية الأنسجة المفروم مع مشرط وعطلت ثم ميكانيكيا بواسطة pipetting المتكررة لإنشاء نظام التعليق الكلي الخلية ^1. ثم يتم تمرير تعليق التجميعية الخلية من خلال شبكة من النايلون 70 ميكرومتر التصفية لإنتاج تعليق خلية واحدة مناسبة للحقن داخل القحف. يتم طرد تعليق الخلية في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية ، وطاف يستنشق قبل إعادة التعليق على بيليه الخلية في الحجم المناسب للمصل خالية من وسائل الإعلام للحصول على تركيز العمل النهائية (أنظر أدناه). لإعداد خطوط الخلايا التي أنشئت لزرع داخل القحف ، ويتم حصاد الخلايا monolayers trypsinizing ، أو عن طريق جمع الثقافات تعليق neurosphere ، ثم الطرد المركزي وإعادة التعليق الخلايا كما هو مبين أعلاه ^2. عدد الخلايا حقن متغير يعتمد على موقع تشريحي عصبي من الحقن. لأننا حقن الحقن فوق الخيمة بشكل روتيني 3-5 × 10 ⁵ خلايا في 3 ميكرولتر من المصل خالية من وسائل الإعلام (DMEM) ، في حين لحقن الدماغ ³ ، يتم حقن القليلة مثل خلايا 5 × ⁴ 10 في 0.5 ميكرولتر. ويمكن ضخ كميات أكبر من الموصى بها نتيجة ارتداد في الخلية السرطانية من خلال المسالك الإبرة ، مع نابتة الناتجة (الشكل 1) ، وبدلا من نمو الورم داخل القحف. بعد سحب العينة للحقن داخل القحف ، يجب وضع تعليق خلية المتبقية في الجليد ، مع محتويات مختلطة في كثير من الأحيان للحفاظ على التركيز المناسب حين الانتهاء من إنشاء ورم داخل الجمجمة بين أعضاء سلسلة الحقن.

2. زرع الخلايا السرطانية

علما ، تم استعراض جميع الإجراءات المذكورة أدناه والتي وافق عليها استخدام الحيوان المؤسسي ولجنة الرعاية في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.

1. وينبغي إعداد المنطقة الجراحية عن طريق الرش كل الأسطح بمطهر مثل حل الكلورهكسيدين 2 ٪. بعد استخدام مطهر ، يجب وضع الإمدادات التالية في مجال العمليات الجراحية :
   • سادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس
   • صغيرين أطباق بتري ، واحدة تحتوي على 3 ٪ فوق أكسيد الهيدروجين ، واحدة تحتوي على الكلورهكسيدين 2 ٪
   • شاش معقم والقطن مسحات
   • المتاح المشارط معقمة
   • دباسة جراحية تعقيمها
2. وينبغي أن تستخدم للتخدير حقن مخدر ؛ عادة خليط الكيتامين - زيلازين.
3. مرة واحدة على فأرة الحاسوب هو تخدير ، مستعدة ينظف فروة الرأس من قبل عدة مرات بقطعة شاش معقم وتراجع في حل الكلورهيكسيدين. وينبغي تطبيق مرهم العين للحفاظ على رطوبة كافية أثناء الإجراء. باستخدام مشرط معقم ، واستكمال شق السهمي على العظم الجداري القذالي ، 1cm حوالي طويلة. ثم يتم تنظيف سطح الجمجمة تعرض باستخدام قطعة قطن مبللة في محلول بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪. ينبغي أن يكون واضحا bregma عند هذه النقطة (انظر الفيديو).
4. سوف تنسق لحقن الخلايا السرطانية تختلف وفقا للموقع المطلوب لإنشاء الورم. التالية يمثل الإجراء نستخدمها لإنشاء الورم الدماغي ² في موقع تشريحي عصبي في العديد من المرضى الذي ورم في المخ تجربة التنمية الورم. مواقع أخرى ذات أهمية في مجال البحوث ورم في المخ وتشمل الجسر ، لنمذجة التشريحية للأورام الدماغ ³ ، وحقن تحت الجافية لنمذجة مكان الأورام السحائية ^4. قبل حقن الخلايا السرطانية ، واستخدام إبر معقمة قياس 25 حاد لثقب في الجمجمة 2 مم إلى يمين وbregma 1 ملم الأمامي إلى الدرز الإكليلي ، وبالتالي خلق فرصة لحقن الخلايا السرطانية (انظر الفيديو). هذا الإجراء يعمل بشكل جيد بالنسبة للفئران والجرذان (22 إبرة قياس بالنسبة للفئران).
5. قبل رسم الخلايا في المحقنة ، مزيج محتويات تعليق خلية بالنقر بإصبعك. تحميل المحاقن مع المبلغ المطلوب من التعليق الخلية ، والحرص على تجنب خلق فقاعات الهواء. وينبغي بعد ذلك خارج محقنة تنظيفها مع مسحة الكحول لتنظيف السطح الخارجي خال من أي خلايا ملتصقة ، والتي سوف تساعد على منع اقامة الورم خارج القحف والنمو (الشكل 1A). لضمان تحقيق عمق الحقن المناسبة ، واستخدام مشرط لقطع 3mm قبالة نهاية وأشار من طرف pipetteman P20. ويمكن تركيب هذا القسم من أكثر من طرف الحقنة ، وسوف تعمل على الحد من عمق الحقن ، وسوف تضمن إضافة إلى ذلك أن منظمة الشفافية الدوليةع من إبرة الحقنة 3mm من الجانب السفلي من الجمجمة. وضع عمودي حقنة في الجمجمة في حفرة والتي تم إنشاؤها مسبقا ، وحقن ببطء تعليق الخلية (ينبغي حقن تعليق 3μL خلال فترة 1 دقيقة). زاوية غير الملائم للالإدراج حقنة يمكن أن يؤدي إلى حقن الخلايا داخل البطيني ونشر العمود الفقري لاحقة (الشكل 1B : حق) عند الانتهاء من الحقن ، وتترك في مكان الإبرة لمدة دقيقة ، ثم سحب ببطء (انظر الفيديو) : وهذه الخطوات تساعد على تقليل ورم الخلايا الجزر.
6. كبديل لنهج دون مساعدة أو خالية اليد الى داخل القحف زرع خلايا الورم ⁵ ، يمكن للمرء استخدام المجسم حيوان صغير الإطار (F نظرة عامة على لوحة من التخطيطي) ، الذي يعزز عموما أكثر تناسقا موقع الحقن ، ولكن على حساب كميات كبيرة من الإجرائية الوقت. في تجربتنا ، يمكن أن اثنين من موظفي العمليات الجراحية لضخ ما يصل إلى 60 الفئران / ساعة عند استخدام نهج حرة مباشرة ، في حين أن أقصى معدل الحقن بإطار الحيوانية المجسم الصغير حوالي 15 الفئران / ساعة. النفعية الإجرائية اعتبار مهم عند حقن الفئران سلسلة كبيرة من ويساعد في تقليل الوقت الذي يتم ترك الخلايا السرطانية ، ليتم حقنه في الجليد.
7. تنظيف الجمجمة مع بيروكسيد الهيدروجين 3 ٪ والجاف باستخدام قطعة قطن معقم جاف. تطبيق الشمع معقمة لثقب العظام. باستخدام الملقط ، واستخلاص فروة الرأس معا خلال الجمجمة والأساسية لإغلاقه. الأمثل للشفاء ، يجب تدبيس فروة الرأس مع الأدمة من كل جانب من فروة الرأس ضد بعضهم البعض (ضد السفلي السفلي). يجب تنظيف فروة الرأس باستخدام تدبيس حل الكلورهيكسيدين ، والبوبرينورفين ثم تدار عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة.
8. رصد جميع الفئران بعد العملية حتى تصبح حركيا والاحتفاظ النشاط العادي. عادة ، وقت الاسترداد حوالي 30 دقيقة.

3. رصد ضوء بارد من نمو الأورام

1. الخلفية. ويستند التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) على أكسدة luciferin [د (--) -2 -- (60 هيدروكسي - 20 - benzothiazolyl) - thiazone - 4 - الكربوكسيلية الحمضية] في وجود الأكسجين ، وثالث فوسفات الأدينوزين (ATP). يتم تحفيز رد الفعل هذا من قبل luciferase الانزيم الذي يحول الطاقة الكيميائية في الانبعاثات الناتجة مع فوتونات الضوء. يمكن تعديل الخلايا البشرية للتعبير عن luciferase (أنظر أدناه) ، مع خلايا فقط ، معربا عن luciferase قادرة على انبعاث الضوء في وجود الركيزة luciferin. هناك حد أدنى من الخلفية التلألؤ تستضيف الحيوانات تعامل مع luciferin ، مثل أن هناك مواتية جدا إشارة إلى الضجيج نسبة انبعاثات للكشف عن التلألؤ من luciferase معدلة والخلايا السرطانية ، مما يتيح رصد حساسة للغاية للنمو الورم واستجابة للعلاج في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، وقد ثبت luciferase وركيزة لها ، luciferin ، إلى أن تكون غير سامة للخلايا الثدييات ، وليس لدينا أي خلافات لوحظ وظيفية بين الخلايا معربا عن النسبية للخلايا معدلة luciferase المقابلة. Luciferin يعبر بسهولة أغشية الخلية وحاجز الدم في المخ بعد داخل الصفاق (IP) أو عن طريق الوريد (IV) حقن الفئران ، مما يسمح التصوير من كل المقصورة التي تحتوي على خلايا معدلة وluciferase. مستوى انبعاث فوتون وطيف الضوء المنبعث من خلايا معدلة وluciferase غير كافية لاختراق أنسجة حيوانات التجارب الصغيرة ، مثل الفئران والجرذان ، ويمكن الكشف عن كاميرات التصوير خارجيا مع الإضاءة المنخفضة. طبيعة موسع التصوير تلألؤ بيولوجي يسمح رصد متكررة من نمو الورم واستجابة للعلاج في المواد الحيوانية الفردية.
2. وينبغي تعديل زرع الخلية مصادر ستابلي للتعبير يراعة luciferase. ويمكن شراء هذه المصادر خلية ، أو المنتجة في مختبرات الفردية باستخدام الفيروسة البطيئة التي تم بناؤها للتعبير التأسيسية للluciferase. نوصي بشدة استخدام الخلايا المعدلة مع ترميز luciferase الفيروسة البطيئة ، بدلا من البلازميد ، لضمان التعبير الخلوية luciferase مستقرة في الجسم الحي ، وهو أمر ضروري للتصوير التلألؤ الكمية لتقديم بيان دقيق للتغيرات في عبء الورم لمواد حيوانية الفردية التي يتم مرارا وتكرارا التقط أثناء تجربة.
3. BLI الرصد. نوصي بإجراء التصوير الكمي تلألؤ بيولوجي (qBLI) 1X - 2X الأسبوعية ، بداية اسبوع واحد بعد حقن الورم الخلية. ويجري لدينا qBLI به لومينا IVIS التصوير محطة (الفرجار علوم الحياة) ، ونتائجنا تشير يتم الحصول على بيانات مماثلة في استخدام لومينا IVIS وIVIS 150 ، أو محطة IVIS التصوير 200. في إطار التحضير للتصوير ، وتخدير الفئران في وقت واحد مع الكيتامين / زيلازين وتدار luciferin (D - Luciferin ملح البوتاسيوم و 150 ملغم / كغم ، الفرجار علوم الحياة) عن طريق الحقن داخل الصفاق ، مع الفئران تصوير 12 دقيقة بعد الحقن. الدوائية للluciferin تشير إلى أن الوقت بين اداريةوينبغي للtration luciferin وتحديد الخلية التلألؤ يكون بين 10-15 دقيقة من الحقن آخر luciferin ، من أجل الحصول على أقصى قدر من الانبعاثات التلألؤ وأعظم حساسية الكشف. ينبغي الإبقاء على المدة الزمنية المحددة في الوقت الفاصل 10-15 دقيقة وثابتة بين الحيوانات التي يتم تصويرها. فمن المهم للغاية للحفاظ على التناسق في طول الفترة الزمنية بين حقن luciferin والحصول على قراءات BLI. وتعرف المناطق ذات الاهتمام تشمل المنطقة داخل القحف إشارة باستخدام البرمجيات المعيش الصورة (الشكل 2) ، ويتم تسجيل photons/s/sr/cm2 الإجمالي (الفوتونات في الثانية لكل ستيراديان لكل سم مربع) (انظر الفيديو).
4. تحليل البيانات. في حين يتم رصد نمو الورم واستجابة العلاج في الحيوانات الفردية ، ونحن نوصي بشدة مجموعات العلاج ما لا يقل عن 8 لزيادة اليقين الإحصائية من الاستنتاجات بشأن استجابة الورم ، أو عدمه ، للعلاج. فيما يتعلق بتقديم نتائج qBLI ، يتم تحويلها إلى قيم قراءات التلألؤ تطبيع بقسمة التلألؤ كل الفأر ثانية ، حصلت أثناء وبعد الانتهاء من النظام العلاجي ، مع المناظر له التألق المعالجة القصوى ^6،7 القراءة. البقاء للتحليل ، يتم استخدام مقدر كابلان ماير ⁸ ، والتي يتم إنشاؤها منحنيات البقاء على قيد الحياة ، وتحدد القيم متوسط ​​بقاء. تتم مقارنة الاختلافات بين منحنيات البقاء على قيد الحياة باستخدام اختبار سجل الرتبة ^9.
5. استرجاع لتحليل الدماغ لاحقة من الورم المعالجة وغير المعالجة. القتل الرحيم على الحيوانات ، ينبغي أن دماغ الفأر رفعه بسرعة (انظر الفيديو) ، وضعت إما في الفورمالين لتحليلها لاحقا مورفولوجيا الورم والمناعية ، أو يجب أن يتم تنظيمها في أكتوبر لتجميد العينات.

4. ممثل النتائج

في المثال هو موضح في الشكل 3A ، تم رصدها داخل القحف حقن الفئران تلقي الخلية السرطانية عن التلألؤ حتى داخل القحف المتعاقبة القيم التقدمية وأشار التلألؤ يعني نمو الورم ، والذي بدأ في وقت العلاج (رمادي بداية السهم في يوم 34 : erlotinib تدار يوميا في 150 ملغ / كغ حتى الموت الرحيم مطلوب). يتم تعيين القيم التلألؤ لكل الماوس إلى قيمة تطبيع من 1 في وقت بدء العلاج ، مع قراءات لاحقة لكل التلألؤ الماوس لتطبيع النهائية المعالجة قيمة التصوير. كمثال ، ماوس مع القراءة النهائية التلألؤ المعالجة المسبقة من x 10 ⁷ الفوتونات 2.0 / ثانية في يوم 34 ، الذي التلألؤ زادت إلى 6.0 × 10 ⁷ والفوتونات / ثانية في يوم 38 ، لديها اليوم 38 قيمة تطبيع التلألؤ من 3.0. يتم رسم يعني تلألؤ بيولوجي طبيعي والخطأ المعياري المطابق للمراقبة والعلاج لكل الفئات التصوير نقطة زمنية. في هذا المثال ، اختلاف كبير في تطبيع تعني التألق الواضح عند نقطة التصوير مرة الأولى بعد بدء العلاج (يوم 38) ، مع الفرق في المجموعة يعني التلألؤ تظهر زيادة في نقاط وقت لاحق. في معظم الحالات ، ويرافق المضادة للورم النشاط من العلاج ، كما يتبين من qBLI ، من خلال الفرق في المقابلة كبيرة في البقاء على قيد الحياة (أي ، ف <0.05) ، كما هو الحال هنا (الشكل 3B). لوحات 3C و 3D الهيماتوكسيلين تظهر متجاورة ويوزين ومعاداة EGFR المقاطع الملون من مخ الفأر التي تم الحصول عليها في وقت من القتل الرحيم ، وبعد وضع الدماغ مقطوعة في الفورمالين واللاحقة لتضمين - البارافين sectioning.

الشكل 1. يدل على أخطاء الحقن داخل القحف. يمكن أن يكون سبب A) نابتة نمو الورم (خارج القحف) (دائرة حمراء) عن طريق الحقن حجم كبير جدا آن ، تعليق المتبقية الخلية التي تعلق على حقنة ، أو من سحب الحقنة بسرعة كبيرة جدا بعد حقن الخلايا السرطانية. يمكن B) حقن الخلايا السرطانية في البطينين قضية نشر العمود الفقري للورم (الماوس إلى اليمين) ، على النقيض من حقن الخلايا السرطانية بشكل صحيح ، والذي يبقى مؤشرا لالمترجمة إلى موقع الحقن (الماوس إلى اليسار).

الشكل 2. تمثيلات الحرارة صورة خريطة كثافة الفئران تلألؤ بيولوجي لممثل من التحكم (يسار) والعلاج (يمين) مجموعات من علاج التجربة الاستجابة. يمكن ضبط البرنامج صورة حية لتحديد المناطق ذات الأهمية (الدوائر الحمراء) ، أو مشغلي أداة يمكن أن تحدد المناطق ذات الاهتمام يدويا. لاستخدام مثل هذه الصور لبناء الشكل ، ونحن نوصي بأن المشغل صك معارض الصور خريطة الحرارة باستخدام الحرارة تلألؤ بيولوجي نفس نطاق الخريطة (الجزء العلوي من الشكل) ، لتوفير التمثيل البصري للمدى الاختلاف بين الموضوعات تلألؤ بيولوجي حيواني.

الشكل 3. ضوء بارد ، وبقاء ، وتحليل الأنسجة السرطانية من تجربة في الاستجابة العلاجية التي هو واضح. وأشار مؤامرة) من قراءات يعني تلألؤ بيولوجي لمكافحة الفئران ومجموعة العلاج ، والخطأ المعياري لكل نقطة التصوير. B) مؤامرة لبقاء الفئران نفسه ؛ ف القيمة المحددة من خلال استخدام سجل الرتبة اختبار ^7. C) H & E القسم الملون من دماغ الفأر مع الورم. D) EGFR القسم الملون. E و F) تكبير المناطق المشار إليه من لوحات C و D ، على التوالي ، مع لوحة تبين E تلطيخ السلبية للورم PTEN البروتين القامع.

Discussion

مثلي ورم في المخ (الجمجمة) إنشاء طعم أجنبي يقدم المكروية المناسبة ⁽¹⁰⁾ لسرطان الجهاز العصبي المركزي النمذجة لفحصها من أجل الاستجابة العلاجية. هذا النوع من النمذجة وبالإضافة إلى ذلك يوفر معلومات بشأن وصول العلاجية لخلايا المخ وورم في المخ ، وهو أمر مهم للغاية لتحديد ما إذا كان ينبغي أن يكون وكيلا تجريبية متقدمة لتقييم التجارب السريرية في المرضى. لأنه لا طعم أجنبي كمية الورم داخل القحف يمكن قياسها بصورة مباشرة ، مثل الفرجار والرصد الطولي للنمو الورم داخل القحف واستجابة للعلاج يتطلب غير الغازية والتصوير ، والتصوير مع تجربتنا تشير تلألؤ بيولوجي باعتبارها النهج الأكثر عملية لتجارب هدفها الأساسي هو تقييم مدى استجابة الورم للعلاج. عندما يتم الجمع بين نتائج التصوير تلألؤ بيولوجي مع موضوع التحليل بقاء الحيوانات ، ومجموعتين من البيانات يوفر طريقة فعالة وموثوق بها لتقييم فعالية علاجية تجريبية.

أخيرا ، من المهم بمكان أن يتم حصاد داخل القحف xenografts ورم في المخ من الموضوعات الحيوان الموت الرحيم من أجل تقييم الآثار المورفولوجي والجزيئي للعلاج ، ولهذا نحن نفضل استئصال كامل الدماغ في وقت للقتل الرحيم ، مع الحفاظ على الدماغ مقطوعة عن تحليل لاحقة.

في حين أحرز العرض السابق محددة للبحث عن ورم في المخ ، والمفاهيم هي بالتأكيد لgeneralizeable السرطانات البشرية الأخرى التي هي قابلة للنمذجة مثلي في القوارض.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable Scapels	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	No.21
Heating Pad	Dunlap	HP950
Gauze	Fisher Scientific	22028563
Cotton Swabs	Fisher Scientific	23-400-100
2% Chlorhexidine	Fisher Scientific	NC9756995
3% Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H312P-4
25g Needle	BD Biosciences	305122
10ul Hamilton Sharp Microsyringe	Hamilton Co	20734
Skin Stapler and Staples	Stoelting Co.	59020
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.	51725
Living Image Software	Caliper Life Sciences
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK-1G	Potassium Salt
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences