הקמת גידול תוך גולגולתי xenografts המוח עם ניתוח בדיעבד של הגידול ואת התגובה לטיפול באמצעות הדמיה פליטת אור

Summary

בלוציפראז, שונה אדם xenografts גידול במוח ניתן לקבוע intracranially בעכברים athymic, עם ניטור הבאים של הגידול ואת התגובה לטיפול באמצעות הדמיה פליטת אור. בשילוב עם ניתוח הישרדות, ניטור פליטת אור הוא כלי מחקר הכרחי לצורך בדיקות טרום קליניים של טיפולים נשקלת לטיפול בגידולים במוח.

Abstract

מודלים באמצעות השתלת גידולים אנושיים לתאי המוח שימשו תפקיד חיוני למחקר נוירו אונקולוגית במשך שנים רבות. בעבר, ההליך הנפוץ ביותר להקמת האדם xenograft הגידול מורכב מאוסף של תאים צלוחיות תרבות, ואחריו הזרקה תת עורית של התאים שנאספו בעכברים immunocompromised. בעוד גישה זו עדיין רואה את השימוש התכוף במעבדות רבות, חל שינוי משמעותי דגש בעשור האחרון להקמת xenograft orthotopic, אשר במקרה של גידולים במוח, מחייבת הזרקה תאים סרטניים לתוך מבנים neuroanatomical המתאים. בגלל הקמת xenograft תוך גולגולתי מבטל את היכולת לעקוב אחר הגידול באמצעות מדידה ישירה, כגון על ידי שימוש מחוגה, השינוי בדגש כלפי orthotopic גידול במוח מודלים xenograft יש חייבה את הניצול של הדמיה לא פולשנית להערכת עול גידול בעלי חיים המארח. השיטות הקיימות כיום הדמיה, ניטור פליטת אור נחשבת בדרך כלל להציע את השילוב הטוב ביותר של רגישות, תועלתנות, ואת העלות. כאן, אנו תדגים נהלי להקמת המוח orthotopic הגידול, לניטור הגידול ואת התגובה לטיפול כאשר בדיקות טיפולים ניסיוניים.

Protocol

1. תאים סרטניים הכנה.

תאים של הגידול xenografts המוח האנושי יכול להיות שמקורו או מגידולים מופצות כמו גידולים בעכברים athymic תת עורית, או תרבית תאים. ניצול שני מקורות תא נדון להלן, יחד עם הפגנה של שיטה להשתלה התא.

כדי להכין תאים מגידולים תת עורית להעברה לתא תוך גולגולתי, גידולים האגף נכרת ממוקמים מנות התרבות, שבו הרקמה טחון בתחילה עם אזמל ולאחר מכן שיבשו באופן מכני על ידי pipetting חוזרות כדי ליצור המצרפי תא ההשעיה ^1. ההשעיה המצרף התא לאחר מכן עבר דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר לסנן לייצר ההשעיה תא בודד מתאים הזרקה תוך גולגולתי. המתלים התא centrifuged בסל"ד 1000 למשך 10 דקות ב 4 ° C, ואת supernatant aspirated לפני resuspending התא גלולה בהיקף המתאים בסרום ללא מדיה להשיג ריכוז העבודה הסופית (ראה להלן). להכנת שורות תאים הוקמה להשתלה תוך גולגולתי, התאים נקצרים על ידי monolayers trypsinizing, או על ידי איסוף תרבויות ההשעיה neurosphere, אז centrifuging ו resuspending התאים כפי שצוין לעיל ^2. מספר התאים מוזרקים תלוי משתנה על מיקום neuroanatomical של זריקה. עבור זריקות supratentorial אנו שגרתי להזריק 3-5 x 10 ⁵ תאים μL 3 של סרום ללא מדיה (DMEM), ואילו עבור המוח ³ זריקות, כמה כמו 5 x 10 ⁴ תאים מוזרקים ב μL 0.5. הזרקת כרכים גדולים יותר מומלץ יכול לגרום ריפלוקס תאים סרטניים דרך מערכת מחט, עם exophytic כתוצאה (איור 1), במקום הגידול תוך גולגולתי. לאחר נסיגה מדגם להזרקה תוך גולגולתי, ההשעיה תא הנותרים יש להציב קרח, עם תוכן מעורב לעתים קרובות כדי לשמור על ריכוז מתאים בעת השלמת הקמת גידול תוך גולגולתי בין חברי סדרה זריקה.

2. תאים סרטניים השרשה

שים לב, כל הנהלים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים ועדת Care באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.

1. אזור הניתוח צריך להיות מוכן על ידי ריסוס כל המשטחים בחומר חיטוי, כגון פתרון chlorhexidine 2%. לאחר השימוש בחומר החיטוי, אספקה ​​הבא צריך להיות ממוקם באזור הניתוח:
   • כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף העכבר
   • שתי צלחות פטרי קטן, אחד המכיל מי חמצן 3%, ואף אחד המכיל chlorhexidine 2%
   • גזה סטרילי כותנה מטליות
   • אזמלים חד פעמי סטרילי
   • מהדק כירורגי Autoclaved
2. עבור הרדמה ההרדמה מוזרק אמור לשמש, בדרך כלל תערובת קטמין-xylazine.
3. לאחר עכבר הוא הרדים, הקרקפת הוא הוכן על ידי בשטיפת מספר פעמים עם פיסת גזה סטרילי טבול הפתרון chlorhexidine. משחת עיניים צריך להיות מיושם כדי לשמור על לחות נאותה במהלך ההליך. באמצעות אזמל סטרילי, להשלים חתך sagittal על עצם parieto-העורפית, 1cm בקירוב רב. פני הגולגולת חשוף הוא ניקה ואז באמצעות מקלון צמר גפן טבול פתרון 3% חמצן. גבחת צריכה להיות ברורה בנקודה זו (ראה וידאו).
4. מרכזת עבור הזרקה של תאים סרטניים ישתנו לפי האתר הרצוי להקמת הגידול. להלן מייצג את ההליך אנחנו משתמשים להקמת הגידול intracerebral ² במיקום neuroanatomical שבו רבים הגידול בחולים המוח לחוות התפתחות הגידול. אתרים נוספים בעלי עניין במחקר גידול במוח כוללים את פונס, דוגמנות האנטומי של המוח גידולים ^3, זריקות subdural דוגמנות את המיקום של גידולים קרום המוח ^4. לפני הזרקת תאים סרטניים, להשתמש במחט סטרילית 25 מד חדה לנקב את הגולגולת ב 2 מ"מ ימינה של גבחת ו 1 מ"מ הקדמי אל תפר העטרה, ובכך ליצור פתח הזרקה של תאים סרטניים (ראה וידאו). הליך זה עובד היטב עבור שני עכברים וחולדות (22 מחט מד עבור חולדות).
5. לפני ציור תאים לתוך המזרק, לערבב את התוכן של השעיה התא על ידי הקשה עם האצבע. טען את המזרק עם כמות הרצויה של השעיה התא, להיות זהיר, כדי למנוע יצירת בועות אוויר. מחוץ של מזרק אז צריך לנקות עם מטלית אלכוהול כדי לנגב את חיצוני ללא כל התאים חסיד, אשר יסייעו למנוע הקמת הגידול בצמיחה extracranial ו (איור 1A). כדי להבטיח את עומק ההזרקה המתאימים מושגת, להשתמש אזמל לחתוך 3mm מקצה הצביע על קצה P20 pipetteman. חלק זה של קצה יכול להיות מצויד על המזרק ותפעל כדי להגביל את עומק ההזרקה, ויהיה בנוסף להבטיח כי טיp של מחט המזרק הוא 3mm מן החלק התחתון של הגולגולת. הנח את המזרק בניצב אל הגולגולת לתוך החור שנוצר בעבר, ולאט לאט להזריק את ההשעיה תא (השעיה 3μL צריך להיות מוזרק במשך 1 דקה). זווית בלתי הולמת של החדרת המזרק יכול לגרום תוך חדרי הזרקה של תאים והפצת השדרה הבאים (1B איור: מימין) עם השלמת הזריקה, להשאיר את המחט במקום עוד דקה, ואז לאט לאט לסגת (ראה וידאו): צעדים אלה יסייעו להפחית תאים סרטניים ריפלוקס.
6. כחלופה לגישה חופשית ללא עזרה או יד תוך גולגולתי השתלת תאים סרטניים ^5, אפשר להשתמש חיה קטנה stereotactic מסגרת (F פאנל של סקירה סכמטית), אשר בדרך כלל מקדם את מיקום ההזרקה עקבית יותר, אבל במחיר של כמויות ניכרות של פרוצדורליות זמן. מניסיוננו, שתי הצוות הכירורגי יכול להזריק רבים כמו 60 עכברים / שעה בעת שימוש בגישה חופשית יד, ואילו שיעור זריקה מקסימלי עם מסגרת חיה קטנה stereotactic הוא כ 15 עכברים / שעה. תועלתנות פרוצדורלי הוא שיקול חשוב כאשר הזרקת סדרה גדולה של עכברים, עוזר להפחית את הזמן שבו תאים סרטניים, להיות מוזרק, נותרים על הקרח.
7. נקו את הגולגולת עם מי חמצן 3% ויבש באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי ויבש. החל שעווה עצם סטרילי אל החור. בעזרת מלקחיים, לצייר את הקרקפת יחד מעל הגולגולת מצרך להיסגר. עבור ריפוי אופטימליים, הקרקפת צריכה להיות מהודקים עם הדרמיס של כל צד של הקרקפת אחד נגד השני (התחתון נגד התחתון). הקרקפת מהודקים יש לנקות באמצעות פתרון chlorhexidine, ואת עצירות מנוהל על ידי הזרקה תת עורית אז להקלה בכאב שלאחר הניתוח.
8. צג כל העכברים שלאחר הניתוח עד שהם הופכים מתנועעים ולשמור פעילות נורמלית. בדרך כלל, זמן ההחלמה הוא סביב 30 דקות.

3. פליטת אור ניטור הגידול

1. רקע. הדמיה פליטת אור (BLI) מבוססת על חמצון של luciferin [d-(-) -2 - (60-hydroxy-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carboxylic חומצה] בנוכחות חמצן אדנוזין טריפוספט (ATP). תגובה זו catalyzed ידי בלוציפראז האנזים, אשר ממירה אנרגיה כימית עם פליטת פוטונים כתוצאה של אור. בתאי אדם יכול להיות שונה כדי להביע את בלוציפראז (ראה להלן), עם רק-בלוציפראז להביע תאים המסוגלים פולטות אור בנוכחות המצע luciferin. יש הארה רקע מינימלי מחיות המארחים שטופלו luciferin, כגון שיש נוחים מאוד אות לרעש יחס לאיתור פליטות הארה מן בלוציפראז-שונה תאים סרטניים, המאפשר ניטור רגיש של הגידול ואת התגובה לטיפול in vivo. יתר על כן, בלוציפראז ואת המצע שלה, luciferin, הוכחו להיות רעיל בתאי יונקים, ויש לנו נצפו הבדלים פונקציונליים בין תאים להביע יחסית בלוציפראז לתאי ללא שינוי המקביל. Luciferin בקלות חוצה קרום התא ואת מחסום דם מוח לאחר intraperitoneal (IP) או תוך ורידי (iv) הזרקה בעכברים, ובכך לאפשר הדמיה של כל תא המכיל בלוציפראז-שונה בתאים. רמת פליטת פוטון הספקטרום של האור הנפלט בלוציפראז-שונה תאים מספיקה לחדור לרקמות חיות מחקר קטן, כמו עכברים וחולדות, וכן ניתן להבחין חיצונית עם תאורה נמוכה מצלמות הדמיה. אופי פולשני של פליטת אור הדמיה מאפשר ניטור חוזרות ונשנות של הגידול ואת התגובה לטיפול בנושאים בעלי חיים בודדים.
2. מקורות תא מושתלים צריך להיות שונה ביציבות לביטוי גחלילית בלוציפראז. מקורות תא כזה ניתן לרכוש, או מיוצר במעבדות בודדים באמצעות lentivirus כי נבנו לביטוי המכונן של בלוציפראז. אנו ממליצים בחום על שימוש בתאי שונה עם lentivirus קידוד בלוציפראז, ולא פלסמיד, כדי להבטיח ביטוי תאית יציבה של בלוציפראז in vivo, אשר הוא הכרחי עבור הדמיה הארה כמותי לספק אינדיקציה מדויקת של השינויים בנטל גידול לנושאים בעלי חיים בודדים, כי הם שוב ושוב צילמו במהלך ניסוי.
3. BLI ניטור. אנו ממליצים על ביצוע הדמיה פליטת אור כמותי (qBLI) 1x-2x שבועי, בתחילת שבוע הבא הזרקת תאים סרטניים. QBLI שלנו מתנהל באמצעות לומינה IVIS הדמיה התחנה (Caliper מדעי החיים), ואת התוצאות שלנו מצביעות על נתונים דומים מתקבלים בשימוש IVIS לומינה, IVIS 150, 200 או לתחנת IVIS הדמיה. לקראת הדמיה, בעכברים מורדמים בו זמנית עם קטמין / Xylazine ומנוהלים luciferin (D-Luciferin מלח אשלגן, 150 מ"ג / ק"ג, Caliper מדעי החיים) באמצעות הזרקת intraperitoneal, עם עכברים צילמו 12 דקות לאחר ההזרקה. פרמקוקינטיקה של luciferin עולה כי הזמן בין תרבות,tration של luciferin והנחישות של הארה התא צריך להיות בין 10-15 דקות הזרקת הודעה של luciferin, כדי להשיג הארה הפליטה המרבי והרגישות ביותר של זיהוי. פרק הזמן שנבחר בתוך מרווח זמן 10-15 דקות יש לשמור כמו קבוע בין החיות נמצאים הדמיה. חשוב מאוד לשמור על עקביות משך הזמן בין הזרקה של luciferin וקבלת קריאות BLI. אזורים של עניין המקיף את שטח תוך גולגולתי של האות מוגדרים באמצעות תמונה Living תוכנה (איור 2), ואת photons/s/sr/cm2 הכולל (פוטונים לשנייה לכל steradian לס"מ מרובע) נרשמות (ראה וידאו).
4. ניתוח נתונים. בעוד הגידול והתגובה לטיפול מנוטרים בבעלי חיים בודדים, אנו ממליצים מאוד קבוצות טיפול של לפחות 8 להגברת הוודאות הסטטיסטית של מסקנות לגבי תגובת הגידול, או היעדרה, לטיפול. לגבי הצגת תוצאות qBLI, קריאות הארה מומרים ערכי מנורמל על ידי חלוקת כל הארה של העכבר, שהושג במהלך ואחרי סיום משטר טיפולי, עם הארה המקדים המקסימלי המתאים קריאה ^6,7. לניתוח הישרדות, Kaplan-Meier הערכת ⁸ משמש, וממנו נוצרות עקומות הישרדות, והערכים חציון ההישרדות נקבע. הבדלים בין עקומות הישרדות מושווים באמצעות מבחן כניסה דרגה ^9.
5. איחזור של המוח ניתוח בדיעבד של הגידול שטופלו ומטופלים כראוי. לאחר המתת חסד בבעלי חיים, במוח של עכבר יש נכרת במהירות (ראה וידאו), והניח גם לניתוח בדיעבד של מורפולוגיה אימונוהיסטוכימיה הגידול בפורמלין, או צריך להיות מותקן בתוך אוקטובר להקפאה הדגימה.

4. נציג תוצאות

בדוגמה המוצגת באיור 3 א, עכברים שקיבלו זריקה תוך גולגולתי תאים סרטניים היו במעקב במשך הארה תוך גולגולתי עד רצופים ערכי הארה אומר הצביעו הגידול פרוגרסיבי, ועל הטיפול בהם זמן יזמה (בראשית החץ האפור יום 34: ארלוטיניב מנוהל מדי יום 150 מ"ג / ק"ג עד המתת חסד חובה). ערכי הארה של כל עכבר מוגדרים ערך מנורמל של 1 בזמן ליזום טיפול, עם קריאות הארה הבאים עבור כל עכבר מנורמל עד גמר ערכו הדמיה המקדים. כדוגמה, עכבר עם קריאה טיפול טרום סופית הארה של 2.0 x 10 ⁷ פוטונים / sec ב 34 יום, אשר הארה עלה ל 6.0 x 10 ⁷ פוטונים / sec בכל יום 38, יהיה 38 יום הארה ערך מנורמל של 3.0. ממוצע פליטת אור מנורמל וטעייה תקן המתאים לבקרה קבוצות הטיפול הם זממו לכל נקודת זמן הדמיה. בדוגמה זו, הבדל משמעותי הארה מנורמל מתכוון לעין בנקודת הפעם הראשונה הדמיה לאחר התחלת הטיפול (יום 38), עם הבדל של הארה הקבוצה מתכוונת להראות גידול נוסף בנקודות זמן עוקבות. ברוב המקרים, אנטי הגידול בפעילות של טיפול, כפי שצוין על ידי qBLI, מלווה הבדל משמעותי בהישרדות המתאים (כלומר, p <0.05), כפי שנהוג כאן (איור 3B). לוחות 3C ו 3D להראות hematoxylin הסמוך & eosin אנטי EGFR סעיפים מוכתם במוח העכבר שהושגו בזמן של המתת חסד, בעקבות המיקום של המוח resected הטבעה ב-פרפין פורמלין ובעקבות עבור חתך.

באיור 1. אינדיקציות של טעויות הזרקה תוך גולגולתי. א) Exophytic (extracranial) הגידול (עיגול אדום) יכולה להיגרם על ידי נפח הזרקה גדול מדי, השעיה תא שיורית מצורף מזרק, או נסיגה את המזרק מהר מדי לאחר הזרקת תאים סרטניים. ב) הזרקת תאים סרטניים לתוך החדרים יכול לגרום להפצת השדרה של הגידול (העכבר ימינה), לעומת התאים הסרטניים מוזרק כהלכה את האות אשר נשאר מקומי כדי הזריקה (העכבר שמאלה).

2. איור מפת חום תמונה ייצוגים של עוצמת פליטת אור על עכברים נציג הביקורת (משמאל) טיפול (מימין) קבוצות הניסוי תגובה לטיפול. התוכנה תמונה חיים ניתן להגדיר להגדיר אזורים של עניין (עיגולים אדומים), או מפעילי מכשיר יכול להגדיר אזורים של עניין באופן ידני. עבור באמצעות תמונות כגון אלה לבניית דמות, אנו ממליצים כי מפעיל המכשיר מציג תמונות מפת חום באמצעות פליטת אור באותו חום המפה טווח (החלק העליון של הדמות), כדי לספק ייצוג חזותי של מידת פליטת אור הבדל בין נבדקים בעלי חיים.

איור 3. פליטת אור, הישרדות, וניתוח רקמת הגידול מניסוי שבו תגובה טיפולית ניכרת. מגרש) של קריאות פליטת אור מתכוון לבקרה קבוצת עכברים טיפול, עם שגיאת התקן הצביעו עבור כל נקודה הדמיה. ב) עלילה הישרדות עכברים זהה; p-value נקבע באמצעות שימוש במבחן log-דרגה ^7. ג) H & E סעיף מוכתם במוח העכבר עם הגידול. ד) EGFR מוכתם סעיף. E ו-F) בהגדלה של אזורים עולה מקולטי C ו-D, בהתאמה, עם פאנל E מראה מכתים שלילי PTEN חלבון מדכא גידולים.

Discussion

הגידול orthotopic (תוך גולגולתי) במוח הקמת xenograft מספק microenvironment המתאים ¹⁰ עבור סרטן דוגמנות CNS להיבדק על תגובה טיפולית. סוג זה של דוגמנות בנוסף מספק מידע באשר לגישה טיפולית המוח גידול במוח, דבר חשוב ביותר לקבוע אם סוכן הניסוי צריך להיות מתקדמים הערכה בניסוי קליני בחולים. בגלל כמות הגידול xenograft תוך גולגולתי לא ניתן למדוד ישירות, כגון על ידי מחוגה, ניטור האורך של הגידול תוך גולגולתי ועל התגובה לטיפול דורש הדמיה לא פולשנית, עם ניסיון ההדמיה שלנו פליטת אור המציין את הגישה המעשית ביותר עבור ניסויים שעיקר המטרה להערכת היקף תגובת הגידול לטיפול. כאשר תוצאות של פליטת אור הדמיה בשילוב עם ניתוח נושא בעלי חיים הישרדות, שתי ערכות נתונים לספק גישה חזקה ואמינה להערכת היעילות הטיפולית ניסיוני.

לבסוף, חשוב מאוד כי תוך גולגולתי הגידול xenografts המוח נקצרים מן הנבדקים בעלי חיים מורדמים על מנת להעריך את ההשפעות מורפולוגיים מולקולרית של טיפול, ועל כך אנו מעדיפים כריתה המוח כולו בזמן של המתת חסד, עם שימור של המוח resected לניתוח שלאחר מכן.

בעוד את המצגת הקודמת נעשתה ספציפית מחקר גידול במוח, מושגים הם בהחלט generalizeable על סרטן אנושיים אחרים ניתנים דוגמנות orthotopic במכרסמים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable Scapels	Feather Safety Razor Co, Ltd.	2975	No.21
Heating Pad	Dunlap	HP950
Gauze	Fisher Scientific	22028563
Cotton Swabs	Fisher Scientific	23-400-100
2% Chlorhexidine	Fisher Scientific	NC9756995
3% Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	H312P-4
25g Needle	BD Biosciences	305122
10ul Hamilton Sharp Microsyringe	Hamilton Co	20734
Skin Stapler and Staples	Stoelting Co.	59020
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.	51725
Living Image Software	Caliper Life Sciences
D-luciferin	Gold Biotechnology	LUCK-1G	Potassium Salt
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences