التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Summary

يتم تنفيذ واحد من قبل خلية التحليل الطيفي على الخلايا النباتية والحيوانية في الضغط الجوي باستخدام الألياف الضوئية لشحذ عينة الخلايا للالتذرية الليزر electrospray التأين (LAESI) مطياف الكتلة.

Abstract

تحليل المواد الكيميائية الحيوية في الخلايا واحد مهم لفهم استقلاب الخلية ، ودورة الخلية ، والتكيف ، والحالات المرضية ، وما إلى ذلك وحتى أنواع الخلايا نفسها معرضا للماكياج والبيوكيميائية غير متجانسة تبعا لظروفها الفسيولوجية ، والتفاعل مع البيئة. الأساليب التقليدية لقياس الطيف الكتلي (MS) المستخدمة لتحليل الجزيئات الحيوية في الخلايا واحدة تعتمد على تحضير عينة واسعة النطاق. ويمكن إزالة الخلايا من بيئتها الطبيعية ، وتجهيز العينات واسعة النطاق تؤدي إلى تغييرات في تركيبة الخلوية. أساليب التأين المحيطة تمكين تحليل العينات في بيئتهم الأصلية ، ودون تحضير عينة واسعة النطاق. ¹ والتقنيات التي تعتمد على الأشعة تحت الحمراء في منتصف التذرية الليزر (منتصف IR) من المواد البيولوجية في الطول الموجي 2.94 ميكرون الاستفادة من الإثارة المفاجئة من المياه التي تنتج في المرحلة وقد أظهرت الانفجار. التأين ² تقنيات البيئة المحيطة استنادا أشعة الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ، مثل الليزر التذرية electrospray التأين (LAESI) والضغط الجوي مصفوفة الأشعة تحت الحمراء بمساعدة الليزر المج التأين (ا ف ب IR - MALDI) ، بنجاح القدرة على تحليل المياه مباشرة والأنسجة الغنية biofluids في الضغط الجوي. ^3-11 وفي LAESI الاجتثاث ليزر تحت الحمراء منتصف عمود التي تتكون في معظمها من الجسيمات المحايدة من coalesces عينة مع قطرات electrospray مشحونة لإنتاج الأيونات. مؤخرا ، أجريت منتصف IR الاجتثاث من الخلايا واحد عن طريق تقديم الإشعاع منتصف الأشعة تحت الحمراء عن طريق الألياف محفورا. وكان postionized السحابة الناتجة من هذا الاجتثاث من قبل electrospray تمكين تحليل الأيضات متنوعة في الخلايا واحد عن طريق LAESI - MS ^(12). توضح هذه المقالة بروتوكول تحليل مفصل للخلية واحدة باستخدام LAESI - MS. عرض شريط الفيديو يظهر تحليل خلية واحدة البشرة من الجلد لمبة CEPA الآليوم. يظهر النظام التخطيطي في الشكل 1. وقدم ممثل المثال الاجتثاث خلية واحدة وطائفة والشامل LAESI من الخلية في الشكل 2.

Protocol

1. مكونات البصرية

1. وينتج عن التذرية الليزر التذرية الليزر electrospray التأين (LAESI) الطيف الكتلي (MS) بواسطة نبضة ليزر 5 نانوثانية في الطول الموجي 2.94 ميكرون. يستخدم ليزر YAG (Opolette 100 ، Opotek شركة ، كارلسباد ، كاليفورنيا) عن الاجتثاث في هذه الدراسة : A الانضباطي مذبذب بارامترية البصرية يقودها الثانية. يتم تحديد معدل تكرار ما بين 5 و 100 هرتز. هذا هو ليزر الدرجة الرابعة على أنه عند التعرض المباشر قد يسبب تلفا دائما شديد في العين أو الجلد. يمكن التفكير منتشر على شعاع الليزر أيضا أن تكون خطرة على الجلد أو العين. ارتداء حملق الليزر المناسبة للحماية.
2. تم الحصول على الألياف الضوئية المصنوعة من الزجاج ثاني أكسيد الجرمانيوم المستندة إلى الأشعة تحت الحمراء من شركة الألياف ، ونظم (سيلفر سبرينغ ، ماريلاند). إذا كان هناك Hytrel بوليميد والطلاء والألياف على اتباع الإرشادات أدناه لإخراجها من الغايات. الحرارة 1 - 2 - الميثيل pyrrolidinone إلى 130-150 درجة مئوية في غطاء الدخان. تراجع الألياف تنتهي تريد الشريط في هذا السائل لحوالي 1 دقيقة أو حتى طلاء تبدأ لتليين وتقشر. تراجع طلاء خففت الى الميثانول أو الأيزوبروبانول لمدة دقيقة ، وتمحو أي طلاء المتبقية مع منديل خالية من الوبر. بعد إزالة طلاء ، يلتصق طرفي الألياف بشفرة الياقوت (KITCO الألياف البصرية ، فيرجينيا بيتش ، فيرجينيا) بتسجيله بلطف والعض عليها.
3. لتحقيق الحدة المطلوبة ، كيميائيا حفر واحدة من نهاية غيض من الألياف بنسبة 1 ٪ (V / V) حامض النيتريك (الصف كاشف) حل. تزج عموديا نهاية مختارة من الألياف في حل حامض على عمق بين 300 و 500 ميكرون بعد الاتصال الأولي. بعد حوالي 15 دقيقة من النقش ، وغيض فصل عفويا من سطح الحمض. هذه النتائج في تلميح الألياف شحذ مع ~ دائرة نصف قطرها 15 ميكرون للانحناء. شطف مع الماء منزوع الأيونات لإزالة أي بقايا الحمض.
4. جبل نهاية محفورا من الألياف على micromanipulator (MN - 151 ، Narishige ، طوكيو ، اليابان) ، وإحضاره إلى مقربة (~ 20 ميكرون) من سطح الخلية لترسب كفاءة في استخدام الطاقة.
5. عقد نهاية غير محفورا من الألياف الضوئية من قبل تشوك الألياف العارية (BFC300 ، Siskiyou المؤسسة والمنح باس ، OR). لمحاذاة البصرية ، هي التي شنت على الألياف تشوك المترجم خمسة المحور (BFT - 5 ، Siskiyou المؤسسة والمنح باس ، OR). ويقترن طاقة الليزر (0،5-1 ميغا جول) في الألياف من خلال التركيز على شعاع من فلوريد الكالسيوم ، بلانو عدسة محدبة أو antireflection ZnSe المغلفة (المنتجات البصرية بالأشعة تحت الحمراء ، فارمنجديل ، نيويورك) إلى نهاية غير محفورا فيها. تستخدم المرايا الذهب المحمية (PF10 - 03 - M01 ، Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) لتوجيه شعاع ليزر تحت الحمراء منتصف العدسة على التركيز.

2. Electrospray الإعداد

1. ويمكن بناء نظام electrospray باستخدام المكونات التالية : الاتحاد مع المعادن الطويق perfluoroelastomer الموصلة ، والتجهيزات ، كم أنابيب وإبر الميناء (على سبيل المثال ، U - 435 ، M215 ، F - 331Nx ، F - 242x ، 9013 ، على التوالي آيدكس الصحة والعلوم ، البلوط هاربور ، واشنطن) ، وكذلك أنابيب تنصهر السيليكا (على سبيل المثال ، CT360 - 100 - 50 - 5 ، الهدف الجديد ، وشركة مدينة وبرن ، ماجستير). يرصد باعث الموصى بها من الفولاذ المقاوم للصدأ ، ولها طرف مدبب مع معرف 50 ميكرومتر (على سبيل المثال ، MT320 - 50 - 5 - 5 ، الهدف الجديد ، وشركة مدينة وبرن ، ماجستير).
2. تجهيز 50 ٪ من محلول الميثانول مع حمض الخليك 0.1 ٪ (V / V) لelectrospray. ويتم ضخ الحل بمعدل من 200 إلى 300 دقيقة / NL بواسطة مضخة محقنة (جهاز هارفارد ، Holliston ، MA) به ، مثلا ، 500 حقنة ميكرولتر (81222 شركة هاملتون ، رينو ، NV)
3. تطبيق الجهد العالي بين 2800 3000 والخامس للاتحاد المعدنية بنسبة إمدادات الطاقة للوائح (PS350 ، ستانفورد للأبحاث سيستمز ، سانيفيل كاليفورنيا) لإنشاء electrospray مطرد. تأكد من أن جميع التوصيلات الكهربائية آمنة ومحمية بشكل صحيح مع أسس التدريع. يمكن الاتصال مباشرة مع الجهد العالي يتعرض نتيجة لصدمة كهربائية.

3. نموذج التعامل مع

1. الحصول على عينة الأنسجة الحية أو خلية من مصدر المناسبة والاحتفاظ بها على النحو الموصى به من قبل التحليل. تم شراء المصابيح الآليوم CEPA لهذه التظاهرة من أحد المتاجر المحلية. قطع بصلة طوليا بواسطة مشرط الجراحة. وكان جزء قليل من السنتيمتر مقياس مقطوع في قطاع غزة. غير مقشر لأحادي الطبقة سليمة من أنسجة البشرة الداخلية قبالة.
2. يستخدم السطح الرطب للبشرة لتركيب الأنسجة على شريحة المجهر والزجاج قبل تنظيفها. عقد الشريحة من قبل صاحب الهدف العام لوحة (FP01 ، Thorlabs شركة ، نيوتن ، نيوجيرسي) التي شنت على مرحلة الترجمة من ثلاثة محاور لتحديد المواقع. الحصول على أطياف الشامل مباشرة بعد تركيب العينة لمنع تدهور الخلايا.

4. التصور النظام

1. وتستخدم المجاهر اثنين لمسافات طويلة لتحديد الخلايا لتحليل والحفاظ على المسافة بين طرف شحذ الألياف وسطح الخلية. هي التي شنت هذه الأخيرة تحت زاوية 15 درجة -30 ° تقاس من السطح. هذا النظام يتكون من مجلةتصحيح اونج المجهر الفيديو عن بعد (7X دقة التكبير البصري ، ادموند البصريات ، بارينغتون ، ونيو جيرسي) مع اللانهاية 5X عدسة الهدف (M آبو خطة 5X ، شركة شركة ميتيو تويو ، كاناغاوا ، اليابان) مزودة كاميرا CCD (مارلن F131 ، الحلفاء الرؤية تكنولوجيز ، Stadtroda ، ألمانيا) لرصد والتقاط الصور.
2. هي التي شنت المجهر الفيديو الثاني في الزاوية اليمنى لسطح العينة لتصور خلايا من أعلى. هذا النظام يوفر التغذية الراجعة المرئية لمحاذاة الحافة الألياف على الخلية المحددة في اقتلاع والتحليل. وهو يتألف من دقة التكبير البصري 7X (ادموند البصريات ، بارينغتون ، نيوجيرسي) ، مزودة اللانهاية 10X تصحيح الهدف طويل المسافة عمل العدسة (M خطة آبو 10X ، شركة شركة ميتيو تويو ، كاناغاوا ، اليابان) وكاميرا CCD.

5. اقتناء الأطياف الشامل

1. بدوره على الليزر ، electrospray ومطياف الكتلة ، على سبيل المثال ، وهو رباعي نظام وقت من الرحلة (Q - TOF رئيس مجلس الوزراء ووترز ، ميلفورد ، MA). تحسين هندسة مصدر ايون LAESI عن طريق ضبط الموقف من بقعة التذرية ، وباعث electrospray بالنسبة لبعضها البعض ، وفتحة لمطياف الكتلة لتحقيق أقصى كثافة الأيونات.
2. حدد خلية من الاهتمام للتحليل باستخدام نظام التصور أعلى عرض. بعد الاختيار ، وتحرك في المرحلة عينة لجعل الخلية المحددة مباشرة تحت الحافة شحذ من الألياف البصرية. باستخدام المجهر جنبا عرض تعدل تلميح إلى سطح الخلية المسافة إلى 20 ميكرون ~.
3. نبضات الليزر النار على الخلية المحددة خلال قمة الألياف محفورا. هذه النتيجة في ثقب في جدار الزنزانة ، وطرد من السيتوبلازم في شكل جسيمات. وتسجل بعد من قبل postionization electrospray ، يتم جمع الأيونات التي تنتجها مطياف الكتلة والأطياف الشامل.
4. بعد الحصول على البيانات ، ووضع ليزر ، electrospray ومطياف الكتلة في وضع الاستعداد أو إيقاف تشغيلها. إبقاء ألف ablated CEPA عينات الأنسجة لمراقبة الاختياري المجهر الضوئي.

6. ممثل النتائج

نجاح الاجتثاث من النتائج خلية واحدة في انفجار جدار الخلية وجمع طائفة LAESI الشامل. تجربة ناجحة النتائج عادة في أي الاجتثاث و / أو أي الطيف الشامل. لأغراض العرض التوضيحي ، ونحن تقديم النتائج من تحليل LAESI - MS من خلية واحدة البشرة جزءا لا يتجزأ من ألف CEPA مبة. ويبين الشكل 2A ممثل صورة المجهر الضوئي بعد أخذ عينات من خلية. جدار الخلية غير مثقوبة ، ويقتصر مدى ثقب من الحدود مع الخلايا المجاورة. الخلايا المجاورة تبدو سليمة. ويبين الشكل 2B كتلة LAESI ممثل الطيف المنتجة من الخلية. تم الكشف عن مجموعة واسعة من الأيونات من ألف CEPA الخلية واستنادا كتلها دقيقة ، وأنماط توزيع النظائر ، وذلك ، في بعض الحالات ، جنبا إلى جنب أطياف الشامل ، ويتم تعيين مؤقت لانهم الأيضات الذاتية. وكان الكشف عن الأيونات من خلية واحدة مماثلة لتلك التي لوحظت في تحليل الأنسجة نفسها التقليدية LAESI - MS من عدة خلايا. ¹³

الشكل 1. التخطيطي التحليل خلية واحدة بواسطة LAESI - MS. ويقترن نبضة ليزر تحت الحمراء منتصف إلى الألياف الضوئية وتسليمها الى وضع العينة على الشريحة الزجاجية. غيض من الألياف شحذ يركز الضوء في الخلية المستهدفة والطاقة المودعة رشقات نارية الخلية. يتم دمج عمود الاجتثاث المنتجة (النقط الحمراء) مع عمود electrospray (النقاط السوداء) وتتجمع قطرات (نقطة خضراء) مما أدى إلى إنتاج أيون عينة محددة. ويتم تحليل هذه الأيونات والكشف عنها بواسطة مطياف الكتلة (MS). وتستخدم اثنين من المجاهر الفيديو لمسافات طويلة ، مجهر مجهر 1 و 2 ، لرصد المسافة بين طرف والألياف على سطح الخلية وتحديد خلية للتحليل ، على التوالي.

الشكل 2A. تذرية علامة على خلية واحدة من البشرة A. CEPA مبة. الخلايا المجاورة لا يحمل الضرر وضوحا وبالتالي يمكن تحليلها بشكل منفصل.

الرقم 2B الطيف الشامل. المقابلة لالاجتثاث من ألف واحد CEPA البشرة الخلية يظهر وجود مستقلبات الابتدائية والثانوية.

Discussion

محتوى الماء من السيتوبلازم الخلية والشد من جدار أو غشاء الخلية هي العوامل الحاسمة التي تنظم الاجتثاث من الخلايا واحدة خلال LAESI - MS التحليل. وفلوينس الليزر لابد من تعديلها لتصل إلى عتبات الاجتثاث من أنواع مختلفة من الخلايا. والقى فلوينس الليزر يعتمد على الطاقة من نبضة ليزر ، وعلى المسافة بين طرف والألياف على سطح الخلية. التقليل من اضطراب الخلايا المجاورة خلال التحليل خلية واحدة أمر بالغ الأهمية. الحفاظ على طاقة الليزر على عتبة الاجتثاث يحد من تأثير التحليل على الخلايا المجاورة.

واحد من التطبيقات الممكنة والتي تستخدم خلايا واحد كما بكسل الحجمي الطبيعية (voxels) للتصوير الكيميائية MS. مقارنة لجمع البيانات على الشبكة الاصطناعية غالبا مستطيل والكيميائية التصوير من خلية واحدة الأنسجة في وقت من المرجح أن يحتفظ التنظيم المكاني للالتفاعلات الكيميائية الحيوية بين الخلايا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259