ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Summary

ניתוח תא יחיד מבוצע על ידי ספקטרומטריית מסה בתאי צמחים ובעלי חיים בלחץ אטמוספרי באמצעות סיב אופטי מחודד המדגם תאים יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה.

Abstract

ניתוח ביוכימיים בתאים אחד חשוב להבנת מטבוליזם התא, מחזור התא, הסתגלות, מצבי מחלה, וכו 'גם סוגי תאים באותה תערוכה איפור ביוכימיים הטרוגניות בהתאם לתנאי פיזיולוגיים שלהם ואת האינטראקציות עם הסביבה. בשיטות המקובלות של ספקטרומטריית מסה (MS) המשמשים לניתוח של ביומולקולות בתא בודד להסתמך על הכנה מדגם נרחב. הסרת תאים בסביבתם הטבעית ועיבוד מדגם נרחב יכול להוביל שינויים בהרכב הסלולר. שיטות יינון אמביינט לאפשר ניתוח של דגימות בסביבה המקורית שלהם, ללא הכנה מדגם נרחב. ¹ הטכניקות המבוסס על אבלציה אמצע לייזר אינפרא אדום (אמצע IR) של חומרים ביולוגיים באורך גל 2.94 מיקרומטר לנצל את עירור פתאומית של מים כי תוצאות שלב הפיצוץ. ² שיטות יינון אמביינט מבוסס על קרינה אמצע IR לייזר, כגון יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ובלחץ אטמוספרי אינפרא אדום מטריצה ​​בעזרת לייזר יינון desorption (AP IR-MALDI), הוכיחו בהצלחה את היכולת לנתח ישירות מים רקמות עשירות biofluids בלחץ אטמוספרי. ^3-11 ב LAESI אמצע IR אבלציה לייזר פלומת כי בעיקר מורכב של חומר חלקיקי ניטרלי מן המדגם מתמזגת עם טיפות electrospray טעון לייצר יונים. לאחרונה, אמצע IR אבלציה של תאים בודדים בוצעה על ידי מתן קרינה אמצע IR באמצעות סיב חרוט. פלומת שנוצר אבלציה זה היה postionized ידי electrospray המאפשר ניתוח של מטבוליטים שונים בתאי יחיד על ידי LAESI-MS. ¹² מאמר זה מתאר את פרוטוקול מפורט לניתוח תא בודד באמצעות LAESI-MS. הסרטון הציג מדגים את הניתוח של תא אפידרמיס בודד מן העור של הנורה Allium cepa. סכמטי של המערכת מוצג באיור 1. למשל נציג אבלציה תא יחיד קשת מסה LAESI מהתא ניתנים באיור 2.

Protocol

1. רכיבים אופטיים

1. אבלציה לייזר עבור יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה (MS) מופק על ידי 5 ns הדופק לייזר באורך גל 2.94 מיקרומטר. מתנד אופטי מתכונן פרמטרית מונע על ידי Nd: YAG לייזר (Opolette 100, Opotek Inc, בקרלסבד, קליפורניה) משמש אבלציה במחקר זה. שיעור החזרה נבחר בין 5 ל 100 הרץ. זהו לייזר בכיתה ד 'כי בחשיפה ישירה עלולה לגרום לנזק בלתי הפיך חמור בעין או העור. השתקפות מפוזר של קרן לייזר יכולה להיות גם מסוכנת העור או העיניים. לבשי goggle לייזר מתאים להגנה.
2. סיב אופטי עשוי זכוכית דו מבוססי גרמניום התקבל אינפרא מערכות סיבים, Inc (Silver Spring, MD). אם יש Hytrel ו polyimide ציפויים על הסיב בצע את ההוראות שלהלן כדי להסיר אותם מן הקצוות. מחממים 1-methyl-2-pyrrolidinone ל 130-150 מעלות צלזיוס במנדף קטר. טובלים את קצות הסיבים אתה רוצה להתפשט לתוך הנוזל הזה דקות או עד כ 1 ציפוי מתחיל להתרכך להתקלף. טובלים את ציפוי מרוככת לתוך מתאנול או isopropanol לרגע, ולנגב את כל ציפוי הנותרים עם מפית ונטולת מוך. לאחר הסרת ציפוי, לדבוק בשני הקצוות של סיבים עם להב ספיר (KITCO סיבים אופטיים, וירג'יניה ביץ', VA) כשקלע בעדינות מצלם אותם.
3. כדי להשיג את חדות הרצוי כימית סוף לחרוט אחד קצה סיב ב -1% (v / v) חומצה חנקתית (כיתה מגיב) פתרון. אנכית לטבול את קצה נבחרים של סיבים לתוך התמיסה חומצה עד לעומק של 300-500 מיקרומטר לאחר המגע הראשוני. לאחר כ 15 דקות של תחריט, הטיפ יהיה ספונטני להתנתק מפני השטח חומצה. התוצאה היא קצה סיב חידד עם רדיוס 15 ~ מיקרומטר של עקמומיות. לשטוף עם מים deionized כדי להסיר שאריות חומצה.
4. הר סוף חרוט של סיבים על micromanipulator (MN-151, Narishige, טוקיו, יפן) ולהביא אותו אל קרבה (~ 20 מיקרומטר) של תא השטח להפקדה לחיסכון באנרגיה.
5. החזק את קצה שאינם חרוט של סיב אופטי באמצעות סיב צ'אק חשוף (BFC300, Siskiyou Corporation, Pass מענקים, OR). במשך יישור אופטי, צ'אק הסיבים הוא רכוב על המתרגם חמש ציר (BFT-5, Siskiyou Corporation, Pass מענקים, OR). אנרגיית הלייזר (0.5-1 mJ) הוא בשילוב לתוך סיב על ידי מיקוד אלומת ידי פלואוריד Plano-קמור סידן או ZnSe מצופה antireflection העדשה (מוצרים אופטיים אינפרא אדום, Farmingdale, ניו יורק) על סופו הלא חרוט. מראות זהב מוגן (PF10-03-M01, Thorlabs, ניוטון, NJ) משמשים כדי לכוון את אלומת האור אמצע IR לייזר על גבי העדשה מתמקדת.

2. Electrospray ההתקנה

1. המערכת electrospray ניתן לבנות באמצעות הרכיבים הבאים: איגוד מתכת עם טבעת חזוק perfluoroelastomer, אביזרי מוליך, שרוול צינור, מחט הנמל (למשל, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, בהתאמה IDEX בריאות למדעים, Oak Harbor, WA), כמו גם צינורות סיליקה התמזגו (למשל, CT360-100-50-5, ניו המטרה Inc, Woburn, MA). פולט המליצה עשוי נירוסטה בעל קצה קוני עם מזהה 50 מיקרומטר (למשל, MT320-50-5-5, ניו המטרה Inc, Woburn, MA).
2. הכן פתרון מתנול 50% עם חומצה אצטית 0.1% (v / v) עבור electrospray. הפתרון נשאבים בקצב של מינימום 200-300 / nl ידי משאבת מזרק (הרווארד Apparatus, Holliston, MA) באמצעות, למשל, מזרק 500 μl (81,222, חברת המילטון, רינו, NV).
3. החל מתח גבוה בין 2800 ו - 3000 V לאיגוד מתכת על ידי אספקת חשמל מוסדר (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) כדי ליצור electrospray יציב. ודא שכל חיבורי החשמל הם בטוחים מוגן עם סיכוך מוארקים כיאות. מגע ישיר עם מתח גבוה חשופה עלולה לגרום להתחשמלות.

3. לדוגמה טיפול

1. השג את רקמת חיים או דגימת תאים ממקור המתאים ולשמור אותם מומלץ כמו לפני ניתוח. נורות Allium cepa להפגנה זו נרכשו בחנות המקומית. גזור נורה longitudinally ידי אזמל מנתחים. קטע סנטימטר כמה בקנה מידה נותח לרצועה. Monolayer שלם של רקמת אפידרמיס הפנימי הוא קילף.
2. המשטח הרטוב של האפידרמיס משמש הר רקמה על שקופית מראש לנקות מיקרוסקופ זכוכית. החזק את השקופית על ידי בעל לוחית בכלל מטרה (FP01, Thorlabs בע"מ, ניוטון, NJ) רכוב על הבמה שלוש ציר תרגום מיצוב. רוכשת את הספקטרום המונית מיד לאחר ההרכבה את המדגם כדי למנוע השפלה התא.

4. ויזואליזציה מערכת

1. שני מיקרוסקופים למרחקים ארוכים משמשות כדי לבחור את התאים לניתוח כדי לשמור על המרחק בין קצה סיב חידד את שטח פני התא. האחרון הוא רכוב תחת זווית ° 15 ° -30 נמדד מפני השטח. מערכת זו מורכבת אלוידאו אונג מרחק מיקרוסקופ (זום אופטי 7x דיוק, אדמונד אופטיקה, ברינגטון, NJ) עם אינסוף 5x לתקן עדשה אובייקטיבי (Apo M תוכנית 5x, Mitutoyo ושות', קאנאגאווה, יפן) מצויד במצלמת CCD (מרלין F131, בעלות הברית ויז'ן טכנולוגיות , Stadtroda, גרמניה) לניטור לכידת תמונה.
2. המיקרוסקופ וידאו השני הוא רכוב בזווית ישרה אל פני השטח מדגם לדמיין את התאים מלמעלה. מערכת זו מספקת משוב חזותי כדי ליישר את קצה סיב על התא הנבחר עבור אבלציה וניתוח. זה מורכב דיוק זום אופטי 7x (אדמונד אופטיקה, ברינגטון, NJ), מצויד באינסוף 10x תיקן עבודה ארוכות אובייקטיבי מרחק העדשה (M תוכנית Apo 10x, Mitutoyo ושות', קאנאגאווה, יפן) מצלמה CCD.

5. רכישת ספקטרה המוניים

1. הפעל את הלייזר, את electrospray ואת ספקטרומטר מסה, למשל, מערכת quadrupole הזמן של הטיסה (Q-TOF פרמייר, ווטרס, Milford, MA). מטב את הגיאומטריה של המקור יון LAESI ידי התאמת המיקום של המקום אבלציה ו פולט electrospray ביחס אחד לשני ואת פתח של ספקטרומטר מסה להשיג בעוצמות יון מקסימלית.
2. בחר את התא עניין לניתוח באמצעות מערכת העליונה להציג ראיה. לאחר הבחירה, להזיז את הבמה מדגם להביא את התא הנבחר ישירות מתחת קצה מחודד של סיב אופטי. באמצעות מיקרוסקופ צד להציג להתקין מחדש את קצה אל תא השטח המרחק ~ 20 מיקרומטר.
3. אש פעימות לייזר בתא הנבחר דרך קצה סיב חרוט. זו התוצאה ניקוב של קיר התא לבין פליטה של ​​בציטופלסמה בצורה של חומר חלקיקי. לאחר postionization ידי electrospray, היונים המיוצרים נאספים על ידי ספקטרומטר מסה ספקטרה מסה נרשמות.
4. לאחר רכישת נתונים, לשים את לייזר, electrospray ואת ספקטרומטר מסה במצב המתנה או לכבות אותם. שמור את א ablated cepa דגימה להסתכלות אופציונלי על ידי מיקרוסקופ אור.

6. נציג תוצאות

אבלציה מוצלחת של התוצאות תא בודד בתוך התפוצצות של התא הקיר ואת האוסף של הספקטרום מסה LAESI. ניסוי מוצלח בדרך כלל התוצאות לא אבלציה ו / או לא ספקטרום המונית. למטרות הדגמה, אנו מציגים את התוצאות מניתוח LAESI-MS של תא בודד אפידרמיס מוטבע א cepa הנורה. ציור 2a מראה תמונה נציג מיקרוסקופיה אופטית לאחר דגימה של תא. דופן התא הוא מחורר והיקף ניקוב הוא מוגבל על ידי גבולות עם תאים שכנים. תאים סמוכים נראה שלם. איור 2b מראה ספקטרום המונית נציג LAESI המופק התא. מגוון רחב של יונים מזוהים מ - א ' cepa סלולריים המבוססים על מסות מדויק שלהם, דפוסי איזוטופ הפצה, במקרים מסוימים, ספקטרה טנדם המונית, הם מוקצים בהיסוס אל מטבוליטים אנדוגני. יונים מזוהה מתא בודד היו דומים לאלה שנצפו בניתוח של רקמות זהה על ידי קונבנציונאלי LAESI-MS של תאים רבים. ¹³

באיור 1. ניתוח סכמטי של תא בודד על ידי LAESI-MS. הדופק אמצע IR לייזר בשילוב לתוך סיב אופטי ונמסרו המדגם להציב בשקופית זכוכית. קצה סיב חידד מתמקד האור לתוך התא היעד ואת האנרגיה שהופקדו התפרצויות התא. פלומת אבלציה המיוצר (נקודות אדומות) היא התמזגה עם פלומת electrospray (נקודות שחורות) הטיפות להתגבש (נקודות ירוקות) וכתוצאה מכך ייצור יון ספציפי המדגם. יונים אלה הם נותחו זוהה על ידי ספקטרומטר מסה (MS). שני ארוכות וידאו מרחק מיקרוסקופים, מיקרוסקופ מיקרוסקופ 1 ו 2, מנוצלים כדי לפקח על המרחק בין קצה סיבים על פני התא כדי לבחור תא לניתוח, בהתאמה.

איור 2 א. אבלציה סימן על תא אפידרמיס בודד של א ' cepa הנורה. תאים סמוכים אינם מציגים נזק לעין, ולאחר מכן ניתן לנתח בנפרד.

איור 2b. המוניים המתאימים אבלציה של א 'אחד ספקטרום תא אפידרמיס cepa מראה נוכחות של מטבוליטים ראשוניים ומשניים.

Discussion

תכולת המים של הציטופלסמה של התא ואת חוזק מתיחה של קיר התא או הממברנה הם גורמים קריטיים הקובעים את אבלציה של תאים בודדים במהלך ניתוח LAESI-MS. השטף הלייזר חייב להיות מותאם כדי להגיע אל סף אבלציה של סוגי תאים שונים. השטף לייזר נמסר תלוי באנרגיה של הדופק לייזר על המרחק בין קצה סיבים על פני התא. צמצום ההפרעות של תאים שכנים במהלך הניתוח תא בודד הוא קריטי. שמירה על אנרגיית הלייזר על סף אבלציה מגביל את ההשפעה של הניתוח על תאים סמוכים.

אחד היישומים האפשריים הוא באמצעות תאים בודדים כמו פיקסלים נפח טבעי (voxels) עבור דימות כימי על ידי MS. לעומת איסוף נתונים על רשת מלבני לעתים קרובות מלאכותי, דימות כימי של תא רקמת אחד בכל פעם, סביר יותר כדי לשמר את הארגון המרחבי של יחסי הגומלין הביוכימיים בין תאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259