Direkte Analyse von Einzelzellen durch Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck

Zusammenfassung

Einzel-Zell-Analyse wird durch Massenspektrometrie an pflanzlichen und tierischen Zellen bei Atmosphärendruck durch eine geschärfte Glasfaser, um die Zellen für die Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) Massenspektrometrie Probe durchgeführt.

Zusammenfassung

Analyse von Biochemikalien in einzelnen Zellen ist wichtig für das Verständnis des Zellstoffwechsels, Zellzyklus, Anpassung, Erkrankungen, etc. Selbst die gleichen Zelltypen heterogene biochemische Zusammensetzung je nach physiologischen Bedingungen und Wechselwirkungen mit der Umwelt aufweisen. Herkömmliche Methoden der Massenspektrometrie (MS) für die Analyse von Biomolekülen in einzelne Zellen verwendet verlassen sich auf umfangreiche Probenvorbereitung. Das Entfernen der Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung und umfangreiche Probenbearbeitung zu Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung führen. Ambient-Ionisation-Methoden ermöglichen die Analyse von Proben in ihrer natürlichen Umgebung und ohne aufwändige Probenpräparation. ¹ Die Techniken, die auf den mittleren Infrarotbereich (mid-IR) Laser-Ablation von biologischem Material bei 2,94 um Wellenlänge basiert die plötzliche Erregung des Wassers zu nutzen, dass die Ergebnisse in Phase Explosion. ² Umgebungstemperatur Ionisierungstechniken auf Mid-IR-Laserstrahlung, wie Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI) und Atmosphärendruck Infrarot-Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (AP IR-MALDI) basieren, haben erfolgreich die Möglichkeit, direkt zu analysieren Wasser-Beweis reichen Geweben und Körperflüssigkeiten bei atmosphärischem Druck. ^3-11 In LAESI mittleren IR-Laser-Ablation plume, die meist aus neutralen Partikel aus der Probe verschmilzt mit hoch geladenen Elektrospray Tröpfchen Ionen zu erzeugen. Kürzlich wurde mid-IR-Ablation von einzelnen Zellen durch die Bereitstellung der mid-IR-Strahlung durch eine geätzte Faser durchgeführt. Die Fahne von diesem Ablation erzeugt wurde von einem Elektrospray ermöglicht die Analyse der verschiedenen Metabolite in einzelnen Zellen durch LAESI-MS postionized. ¹² Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Protokoll für einzelne Zelle Analyse mit LAESI-MS. Das vorgestellte Video zeigt die Analyse einer einzigen Epidermiszelle aus der Haut einer Zwiebel Allium cepa. Die schematische Darstellung des Systems ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für einzelne Zelle Ablation und eine LAESI Massenspektrum aus der Zelle sind in Abbildung 2 dargestellt.

Protokoll

1. Optische Komponenten

1. Laser-Ablation zur Laserablation Elektrospray-Ionisation (LAESI)-Massenspektrometrie (MS) wird durch einen 5 ns Laserpuls bei 2,94 um Wellenlänge erzeugt. Ein abstimmbaren optischen parametrischen Oszillators durch einen Nd getrieben: YAG-Laser (Opolette 100, Opotek Inc., Carlsbad, CA) ist für die Ablation in dieser Studie verwendet. Die Wiederholrate ist zwischen 5 und 100 Hz gewählt. Dies ist eine Klasse IV Laser, der bei direkter Exposition schweren bleibenden Schäden am Auge oder der Haut verursachen können. Die diffuse Reflexion des Laserstrahls kann auch gefährlich für die Haut oder den Augen. Tragen Sie einen geeigneten Laser-Schutzbrille für den Schutz.
2. Die optische Faser von Germanium Kohlendioxid-basierte Glas wurde von Infrarot-Fiber Systems, Inc. (Silver Spring, MD) erhalten. Wenn es Hytrel und Polyimid-Beschichtungen auf der Faser folgen Sie den Anweisungen unten, um sie von den Enden entfernen. Hitze 1-Methyl-2-pyrrolidon zu 130-150 ° C in einem Abzug. Tauchen Sie die Faserenden die Sie in dieser Flüssigkeit für ca. 1 min oder bis die Beschichtung beginnt zu erweichen und zu schälen Streifen. Dip des erweichten Beschichtung in Methanol oder Isopropanol für eine Minute, und wischen Sie alle verbleibenden Beschichtung mit einem fusselfreien Tuch. Nach dem Entfernen der Beschichtung, spalten beide Enden der Faser mit einem Saphir-Klinge (Kitco Fiber Optics, Virginia Beach, VA) durch Ritzen und sanft schnappte sie.
3. Um die gewünschte Schärfe zu erreichen, chemisch etch einem Ende der Faser Spitze um 1% (v / v) Salpetersäure (analysenrein) Lösung. Vertikal eintauchen ausgewählten Ende der Faser in die saure Lösung bis zu einer Tiefe von 300 bis 500 mu m nach dem ersten Kontakt. Nach ca. 15 Minuten Ätzen, wird die Spitze spontan aus der Säure Oberfläche ablösen. Dies führt zu einer geschärften Faserspitze mit ~ 15 &mgr; Krümmungsradius. Spülen mit deionisiertem Wasser auf eine Säure zu entfernen.
4. Montieren Sie den geätzten Ende der Faser auf einem Mikromanipulator (MN-151, Narishige, Tokyo, Japan) und bringen es auf Nähe (ca. 20 mu m) auf der Zelloberfläche zur effizienten Energienutzung Ablagerung zu schließen.
5. Halten Sie das nicht geätzt Ende der optischen Faser von einer nackten Faser Futter (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR). Für die optische Ausrichtung ist die Faser Futter auf einer Fünf-Achs-Übersetzer (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR) montiert. Die Laserenergie (0,5 bis 1 mJ) wird in die Faser durch die Fokussierung des Strahls durch eine plankonvexe Calciumfluorid oder entspiegelt ZnSe Linse (Infrared Optical Products, Farmingdale, New York) auf seine nicht-geätzten Ende gekoppelt. Protected goldenen Spiegeln (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) werden verwendet, um den mittleren IR-Laserstrahl auf die fokussierende Linse zu steuern.

2. Elektrospray-Setup

1. Die Elektrospray-System kann unter Verwendung der folgenden Komponenten: IG Metall mit leitfähigen Perfluorelastomer Zwinge, Armaturen, Schläuche Ärmel-, Nadel-Anschluss (zB U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, jeweils IDEX Health & Sciences, Oak Harbor, WA) sowie Quarzglas Schlauch (zB CT360-100-50 bis 5, New Objective Inc., Waltham, MA). Die empfohlene Emitter ist aus Edelstahl gefertigt und verfügt über eine konische Spitze mit einem 50 um-ID (zB MT320-50-5-5, New Objective Inc., Waltham, MA).
2. Bereiten Sie 50% Methanol-Lösung mit 0,1% Essigsäure (v / v) für die Elektrospray. Die Lösung wird bei einer Rate von 200 bis 300 nl / min durch eine Spritzenpumpe (Harvard Apparatus, Holliston, MA) gepumpt z. B. unter Verwendung einer 500 ul-Spritze (81222, Hamilton Company, Reno, NV).
3. Bewerben hohe Spannung zwischen 2.800 und 3.000 V auf die IG Metall von einem geregelten Netzteil (PS350, Stanford Research Systems Inc, Sunnyvale, CA) zu einem stetigen Elektrospray generieren. Sicherstellen, dass alle elektrischen Anschlüsse sind sicher und geschützt mit der Abschirmung ordnungsgemäß geerdet. Direkter Kontakt mit exponierten hohen Spannung kann zu einem Stromschlag führen.

3. Probenhandhabung

1. Besorgen Sie sich die Live-Gewebe-oder Zellprobe aus einer geeigneten Quelle und halten sie nach wie vor der Analyse zu empfehlen. Die Allium cepa Glühlampen für diese Demonstration wurden von einem lokalen Speicher gekauft. Schneiden Sie eine Zwiebel längs durch einen chirurgischen Skalpell. Ein paar Zentimeter Segment einer Skala wurde im Schnitt zu einem Band. Eine intakte Monolayer der inneren epidermalen Gewebe abgeschält.
2. Die feuchte Oberfläche der Epidermis wird verwendet, um das Gewebe auf einem vorgereinigten Glasobjektträger zu montieren. Halten Sie die Folie von einem Allzweck-Halter (FP01, Thorlabs Inc., Newton, NJ) auf einem Drei-Achsen-Übersetzung Bühne für die Positionierung montiert. Erwerben Sie den Massenspektren nach der Montage sofort die Probe zu Zelle Abbau zu verhindern.

4. Visualization System

1. Zwei lange Strecke Mikroskope verwendet werden, um die Zellen für die Analyse zu wählen und den Abstand zwischen den geschärften Faserspitze und der Zelloberfläche zu halten. Letzteres ist unter 15 ° -30 ° Winkel zur Oberfläche gemessen montiert. Dieses System besteht aus along Abstand Video-Mikroskop (7x Präzision Zoom-Optik, Edmund Optics, Barrington, NJ) mit einem 5-fach unendlich korrigierte Objektiv (M Plan Apo 5x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) mit einer CCD-Kamera (Marlin F131, Allied Vision Technologies ausgestattet , Stadtroda, Deutschland) für die Überwachung und Bilderfassung.
2. Das zweite Video-Mikroskop wird in einem rechten Winkel zur Probenoberfläche angebracht, um die Zellen von der Spitze zu visualisieren. Dieses System bietet visuelles Feedback, um die Faser Spitze über die Zelle für die Ablation und Analyse ausgewählter auszurichten. Es besteht aus einem 7x Präzision Zoom-Optik (Edmund Optics, Barrington, NJ), mit einem 10-fach unendlich ausgestattet korrigiert großem Arbeitsabstand Objektiv (M Plan Apo 10x, Mitutoyo Co., Kanagawa, Japan) und einer CCD-Kamera.

5. Acquisition of Mass Spectra

1. Schalten Sie den Laser, die Elektrospray und das Massenspektrometer, zB ein Quadrupol-Time-of-flight-System (Q-TOF Premier, Waters, Milford, MA). Optimieren Sie die Geometrie der LAESI Ionenquelle durch Einstellen der Position der Ablation Ort und Elektrospray Emitter zueinander und die Öffnung des Massenspektrometers, um maximale Ionenintensitäten erreichen.
2. Markieren Sie die Zelle von Interesse für die Analyse mit Hilfe der Draufsicht Visualisierungssystem. Nach der Auswahl, Verschieben der Probe Bühne, um die markierte Zelle direkt unter der geschärfte Spitze der optischen Faser zu bringen. Mit der Seitenansicht Mikroskop nachjustieren die Spitze-zu-Zell-Oberfläche Abstand zu ~ 20 um.
3. Feuer Laserpulse an der ausgewählten Zelle durch die geätzte Faserspitze. Dieses Ergebnis in die Perforation der Zellwand und den Auswurf des Zytoplasma in Form von Partikeln. Nach postionization durch die Elektrospray, die erzeugten Ionen werden durch das Massenspektrometer und Massenspektren gesammelt werden aufgezeichnet.
4. Nach der Datenerfassung, setzen den Laser, die Elektrospray und das Massenspektrometer in den Standby-Modus oder schalten Sie sie ab. Halten Sie das abgetragene A. cepa Gewebeprobe für optionale Beobachtung mittels Lichtmikroskopie.

6. Repräsentative Ergebnisse

Erfolgreiche Ablation von einer einzigen Zelle führt das Platzen der Zellwand und der Sammlung eines LAESI Massenspektrum. Ein erfolgloser Versuch führt in der Regel keine Ablation und / oder kein Massenspektrum. Zu Demonstrationszwecken, präsentieren wir die Ergebnisse aus dem LAESI-MS-Analyse einer einzigen embedded Epidermiszelle eines A. cepa Glühbirne. Abbildung 2a zeigt eine repräsentative optische Mikroskopie Bild nach der Probenahme einer Zelle. Die Zellwand ist perforiert und das Ausmaß der Perforation ist durch die Grenzen mit den benachbarten Zellen begrenzt. Die benachbarten Zellen scheinen intakt zu sein. Abbildung 2b zeigt eine repräsentative LAESI Massenspektrum von der Zelle produziert werden. Eine Vielzahl von Ionen aus der A. erkannt cepa Zelle und auf der Grundlage ihrer genauen Massen, Isotopenverteilung Muster, und in einigen Fällen, Tandem-Massenspektren, sind sie vorläufig zu endogenen Metaboliten zugeordnet. Die Ionen aus einer einzigen Zelle gefunden wurden ähnlich denen, die in der Analyse des gleichen Gewebes durch konventionelle LAESI-MS von mehreren Zellen beobachtet. ¹³

Abbildung 1. Schematische Darstellung der einzelnen Zelle Analyse LAESI-MS. A mid-IR-Laserpuls wird in eine optische Faser eingekoppelt und an der Probe auf Objektträger aus Glas gelegt. Der geschärfte Faserspitze fokussiert das Licht in die Zielzelle und die deponierte Energie platzt die Zelle. Die erzeugten Ablation plume (rote Punkte) ist mit einer Elektrospray plume (schwarze Punkte) die Tropfen verschmelzen (grüne Punkte), die sich in Probe bestimmte Ionen Produktion zusammengeführt. Diese Ionen werden analysiert und erkannt durch das Massenspektrometer (MS). Zwei lange Strecke Video-Mikroskope, Mikroskop 1 und Mikroskop 2, werden eingesetzt, um Abstand zwischen den Faserspitze und der Zelloberfläche zu überwachen und eine Zelle für die Analyse, bzw. zu wählen.

Abbildung 2a. Ablation Marke auf einer einzigen Epidermiszelle eines A. cepa Glühbirne. Die benachbarten Zellen weisen keine sichtbaren Schäden und anschließend separat analysiert werden.

Abbildung 2b. Massenspektrum entsprechend der Ablation von einem A. cepa Epidermiszelle zeigt das Vorhandensein von primären und sekundären Metaboliten.

Diskussion

Der Wassergehalt des Zytoplasma der Zelle und die Zugfestigkeit der Zellwand oder Membran sind entscheidende Faktoren für die Ablation von einzelnen Zellen während LAESI-MS-Analyse. Die Laserfluenz muss angepasst werden, um die Ablationsschwellen der verschiedenen Zelltypen zu erreichen. Die gelieferte Laserfluenz hängt von der Energie des Laserpulses und der Abstand zwischen den Faserspitze und der Zelloberfläche. Die Minimierung der Störung benachbarter Zellen während der einzelnen Zelle Analyse ist kritisch. Keeping the Laserenergie an der Ablationsschwelle begrenzt die Wirkung der Analyse auf die benachbarten Zellen.

Eine der möglichen Anwendungen ist mit einzelnen Zellen als natürliche volumetrischen Pixel (Voxel) für chemische Bildgebung von MS. Im Vergleich zum Sammeln von Daten auf einer künstlichen oft rechteckigen Raster, ist die chemische Bildgebung eines Gewebes einer Zelle in einer Zeit eher die räumliche Organisation der biochemischen Wechselwirkungen zwischen Zellen behalten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259