Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Özet

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi hücreleri örnek bilenmiş bir fiber optik kablo kullanılarak, atmosferik basınç, bitki ve hayvan hücreleri üzerinde kütle spektrometresi ile tek bir hücre analizi yapılır.

Özet

Tek hücre Biyokimyasalların analizi, aynı hücre türleri bile kendi fizyolojik koşullar ve çevre ile etkileşim bağlı olarak heterojen bir biyokimyasal makyaj sergiler hücre metabolizması, hücre döngüsü, adaptasyon, hastalık durumları, vb anlamak için önemlidir. Kütle spektrometresi (MS), tek hücre Biyomoleküllerin analizi için kullanılan geleneksel yöntemlerin, kapsamlı bir numune hazırlama güveniyor. Kendi doğal ortamı ve geniş numune işleme hücrelerin çıkarılması hücresel bileşimindeki değişikliklere yol açabilir. Ortam iyonizasyon yöntemleri kendi doğal ortamında ve geniş numune hazırlama olmadan numunelerin analizi sağlar. ¹ 2.94 mikron dalga boyunda biyolojik maddeler (orta-IR) orta kızılötesi lazer ablasyon dayalı teknikler su ani uyarma kullanan faz sonuçları patlama ² lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) ve atmosferik basınç kızılötesi matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon (AP IR-MALDI) olarak orta-IR lazer radyasyonu dayalı Ortam iyonizasyon teknikleri, başarılı bir şekilde doğrudan analiz etmek için su yeteneğini göstermişlerdir atmosferik basınç zengin doku ve biofluids LAESI, çoğunlukla iyonları üretmek için yüksek ücret elektrosprey damlacıkları ile örnek pekişen nötr partikül madde oluşur orta-IR lazer ablasyon ^tüy 3-11 . Son zamanlarda, tek hücre orta-IR ablasyon kazınmış bir fiber üzerinden orta-IR radyasyon sunarak yapıldı. Bu ablasyon üretilen tüy LAESI-MS tek hücreleri çeşitli metabolitlerin analizi sağlayan bir elektrosprey postionized ¹² Bu makale LAESI-MS kullanarak tek bir hücre analizi için detaylı bir protokol açıklar . Sunulan video Allium cepa ampul cilde tek bir epidermal hücre analizi göstermektedir. Sisteminin şematik Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreden tek bir hücre ablasyon ve bir LAESI kütle spektrumu bir temsilci örnek Şekil 2'de verilmektedir.

Protokol

1. Optik bileşenler

1. Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi (MS) için lazer ablasyon 5 ns 2.94 mikron dalga boyunda lazer darbe tarafından üretilmektedir. Nd sürülen ayarlanabilir optik parametrik osilatör: YAG lazer (Opolette 100, Opotek A.Ş., Carlsbad, CA), bu çalışmada ablasyon için kullanılır. Tekrarlama oranı 5 ve 100 Hz arasında seçilir. Bu, doğrudan maruz kalması üzerine, göz veya deri ciddi kalıcı hasara neden olabilir bir sınıfı IV lazer. Cisimden yansımalı lazer ışını da cilt veya göz için tehlikeli olabilir. Korunması için uygun bir lazer koruyucu gözlük takın.
2. Germanyum dioksit tabanlı cam fiber optik kablo, Kızılötesi Fiber Systems, Inc (Silver Spring, MD) elde edilmiştir. Orada Hytrel ve fiber kaplamalar ucundan bunları kaldırmak için aşağıdaki yönergeleri izleyin poliimid. Isı 1-metil-2-pyrrolidinone 130-150 ° C davlumbaz. Lif, yaklaşık 1 dakika süreyle ya da kaplama kadar yumuşamaya başlar ve soyulabilir bu sıvı içine şerit istediğiniz biter batırın. Yumuşatılmış kaplama metanol ya da bir dakika izopropanol içine batırın ve kalan herhangi bir kaplama kapalı tüy bırakmayan bir peçete ile silin. Kaplama çıkardıktan sonra, cleave bir safir puanlama ve nazikçe onları yakalamaya bıçak (KITCO Fiber Optik, Virginia Beach, VA) fiber iki ucunda.
3. % 1 (v / v) nitrik asit (saflıkta) çözümü, bir ucunu fiber ucu kimyasal aşındırma istenilen netliği elde etmek için. Dikey seçilen ilk temastan sonra 300 ila 500 mm derinliğe kadar asit çözeltisi içine fiber sonuna bırakın. Gravür yaklaşık 15 dakika sonra, ucu kendiliğinden asit yüzeyinden ayırır. Bu sonuçlar ~ 15 mikron eğrilik yarıçapı ile fiber ucu sivriltilmiş. Herhangi bir asit artıklarını kaldırmak için deiyonize su ile durulayın.
4. Kazınmış sonuna bir micromanipulator lif (MN-151, Narishige, Tokyo, Japonya) Mount ve verimli enerji birikimi için hücre yüzey yakınlığı (~ 20 mm) yakın getirmek.
5. Mandren (BFC300, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR) tarafından çıplak fiber optik fiber olmayan kazınmış sonunda tutun. Optik uyum sağlanabilmesi için, fiber mandreni beş-eksenli bir tercüman (BFT-5, Siskiyou Corporation, Grants Pass, OR) monte edilir. Lazer enerjisi (0,5 - 1 mJ), non-kazınmış ucuna bir yüzü düz diğeri dışbükey kalsiyum florür veya yansıma önleyici kaplama ZnSe objektif (Kızılötesi Optik Ürünler, Farmingdale, NY) ışın odaklama elyaf haline birleştirilmiştir. Korumalı altın aynalar (PF10-03-M01, Thorlabs, Newton, NJ) odaklama lens üzerine orta-kızılötesi lazer ışını yönlendirmek için kullanılır.

2. Elektrosprey Kurulum

1. Elektrosprey sistemi aşağıdaki bileşenleri kullanılarak inşa edilebilir iletken perfluoroelastomer halkalı, bağlantı parçaları, boru kol, iğne bağlantı noktası (örneğin, U-435, M215, F-331Nx, F-242x, 9013, IDEX Sağlık ve Bilim, metal sendikası: Oak Harbor, WA) yanı sıra erimiş silika tüp (örneğin, CT360-100-50-5, Yeni Amaç A.Ş., Woburn, MA). Tavsiye edilen yayıcı paslanmaz çelikten imal edilmiş ve 50 mikron id (örneğin, MT320-50-5-5, Yeni Amaç A.Ş., Woburn, MA), konik bir uç vardır.
2. Elektrosprey için% 0.1 asetik asit (v / v)% 50 metanol çözeltisi hazırlayın. Çözümünü kullanarak bir şırınga pompası (Harvard Apparatus, Holliston, MA) tarafından 200 ile 300 nl / dak hızında pompalanır, örneğin, 500 ul şırınga (81.222 Hamilton Şirket, Reno, NV).
3. 2.800 ve 3.000 V arasındaki yüksek gerilim, sürekli bir elektrosprey oluşturmak için düzenlenmiş bir güç kaynağı (PS350, Stanford Araştırma Sistemleri A.Ş., Sunnyvale, CA) tarafından metal sendika uygulayın. Tüm elektrik bağlantılarını güvenli ve düzgün topraklanmış koruma korumalı olduğundan emin olun. Maruz kalan yüksek gerilim ile doğrudan temas, elektrik çarpmasına neden olabilir.

3. Numune Alma

1. Uygun bir kaynaktan canlı doku ya da hücre örneği elde etmek ve bunları analiz yapılması tavsiye tutmak. Bu gösteri için Allium cepa ampuller yerel bir mağazadan satın alındı. Uzunlamasına bir ampul bir cerrahi neşter tarafından kesin. Bir ölçekte birkaç santimetre segment bir şerit içine kesitli oldu. Iç epidermal dokusunun sağlam bir tek tabaka sıyrılır.
2. Epidermisin ıslak yüzey doku önceden temizlenmiş cam mikroskop lamı üzerine monte etmek için kullanılır. Konumlama için üç eksenli bir çeviri sahnede monte genel amaçlı bir plaka tutucu (FP01, Thorlabs A.Ş., Newton, NJ) slayt tutun. Hücre bozulmasını önlemek için örnek montaj hemen sonra kütle spektrumları edinin.

4. Görüntüleme Sistemi

1. İki uzun mesafe mikroskoplar analiz için hücreleri seçin ve bilenmiş fiber ucu ve hücre yüzeyi arasındaki mesafeyi korumak için kullanılır. Sonuncusu yüzeyinden ölçülen 15 ° -30 ° açı altında monte edilir. Bu sistem al5x sonsuz ong mesafe video mikroskobu (7x hassas optik zum, Edmund Optik, Barrington, NJ) düzeltilmiş bir CCD kamera ile donatılmıştır (Marlin F131, Müttefik Vizyon Teknolojileri objektif lens (M 5x Planı Apo, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japonya) Stadtroda, Almanya), izleme ve görüntü yakalamak için.
2. Ikinci video mikroskop üst hücreler görselleştirmek için örnek yüzeyine dik açıda monte edilir. Bu sistem, ablasyon ve analiz için seçilen hücrenin üzerine fiber ucu hizalamak için görsel geribildirim sağlar. Uzun çalışma mesafesi objektif lens (10x M Planı Apo, Mitutoyo Co, Kanagawa, Japonya) ve bir CCD kamera, 10x sonsuza ile donatılmış 7x hassas zum optik (Edmund Optik, Barrington, NJ), oluşur düzeltildi.

5. Kitle Spectra alımı

1. Lazer, elektrosprey ve kütle spektrometresi, örneğin, bir quadrupole zaman uçuş sistemi (S-TOF Premier, Waters, Milford, MA) açın. Ablasyon spot ve elektrosprey birbirlerine göre verici ve maksimum iyon yoğunlukları ulaşmak için kütle spektrometresi ağzı pozisyonunu ayarlayarak LAESI iyon kaynağı geometri optimize edin.
2. Üst görünümü görüntüleme sistemi kullanılarak analiz için faiz hücreyi seçin. Seçimden sonra, doğrudan fiber optik ucu sivriltilmiş altında seçili hücre getirmek için örnek sahne taşıyın. ~ 20 mm ucu-hücre yüzeyinde mesafe yan mikroskop kullanarak tekrar ayarlayın.
3. Yangın kazınmış fiber ucu ile seçili hücre lazer bakliyat. Bu sonuç, hücre duvarı ve partiküler madde şeklinde sitoplazma ejeksiyon delinme. Elektrosprey postionization sonra, üretilen iyonlar kütle spektrometresi ve kütle spektrumları tarafından toplanan kaydedilir.
4. Veri toplama sonra, lazer, elektrosprey ve bekleme modunda kütle spektrometresi koymak veya bunları kapatın. Ablasyon A. tutun cepa, ışık mikroskobu ile isteğe bağlı gözlem için doku örneği.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Başarılı ablasyon, hücre duvarı ve bir LAESI kütle spektrumu toplanması patlama tek bir hücre. Başarısız bir deney, genellikle hiçbir ablasyon ve / veya kütle spektrumu sonuçları. Gösteri amaçlı, biz tek bir gömülü A. epidermal hücre LAESI-MS analiz sonuçlarını sunmak cepa ampul. Şekil 2a, bir hücrenin örnekleme sonra, temsili bir optik mikroskop görüntü gösterir. Hücre duvarı delikli ve perforasyonu ölçüde komşu hücrelerle sınırları ile sınırlıdır. Bitişik hücreleri sağlam gibi görünüyor. Şekil 2b hücreden üretilen bir temsilcisi LAESI kütle spektrumu gösterir. Iyonları çok çeşitli A. tespit cepa hücre ve onların doğru kitlelere göre, izotop dağılım şekilleri ve bazı durumlarda, tandem kütle spektrumları, onlar geçici endojen metabolitler atanır. Tek bir hücrenin tespit iyonları birden fazla hücre geleneksel LAESI-MS ile aynı doku analizi gözlenen olanlara benzerdi. ¹³

Şekil 1. LAESI-MS ile tek bir hücre analizi şematik. Orta-IR lazer darbesi bir fiber optik birleştiğinde cam slayt üzerine yerleştirilen numune teslim edilir. Bilenmiş lif ucu hedef hücre içine ışık odaklanır ve yatırılan hücrenin enerji patlamaları. Üretilen ablasyon tüy (kırmızı noktalar) örnek spesifik iyon üretim damlacıkları kaynasabilirler bir elektrosprey tüy (siyah noktalar) (yeşil nokta) ile birleşti. Bu iyonlar analiz ve kütle spektrometresi (MS) tarafından tespit edilir. İki uzun mesafe Video mikroskoplar, Mikroskop 1 ve Mikroskop 2, fiber ucu ve hücre yüzeyi arasındaki mesafe izlemek ve analiz için bir hücre sırasıyla seçmek için kullanılmaktadır.

A. tek bir epidermal hücre Şekil 2a. Ablasyon işareti cepa ampul. Bitişik hücreleri görünür bir hasar göstermezler ve daha sonra ayrı ayrı analiz edilebilir.

Bir tek A. ablasyon karşılık gelen Şekil 2b. Mass Spektrum cepa epidermal hücre birincil ve ikincil metabolitleri varlığını gösterir.

Tartışmalar

Hücre bir sitoplazma ve hücre duvarı ya da membran çekme dayanımı, su içeriği LAESI-MS analizi sırasında tek hücre ablasyon düzenleyen kritik faktörlerdir. Lazer fluens farklı hücre tiplerinin ablasyon eşikleri ulaşmak için ayarlanmalıdır. Teslim lazer fluens, lazer darbe enerji ve fiber ucu ve hücre yüzeyi arasındaki mesafeye bağlıdır. Komşu hücreleri tek bir hücre analizi sırasında pertürbasyon en aza indirilmesi önemlidir. Ablasyon eşiğinde lazer enerjisi tutulması komşu hücreleri üzerindeki etkisini analiz sınırlar.

Potansiyel uygulamalardan biri tek hücre MS kimyasal görüntüleme için doğal hacimsel piksel (vokseller) olarak kullanıyor. Yapay genellikle dikdörtgen bir ızgara üzerinde veri toplama ile karşılaştırıldığında, bir defada bir doku bir hücre kimyasal görüntüleme hücreleri arasındaki biyokimyasal etkileşimler mekansal organizasyon korumak için daha olasıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Fluka	45727
Methanol	Fluka	65548
1-methyl-2-pyrrolidinon	Sigma-Aldrich	M79603
Water	Fluka	39259