تسجيلات كاملة من خلية دماغ ذبابة الفاكهة الكبار

Summary

هذا الفيديو يوضح الإجراء لعزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل واحدة من الخلايا العصبية باستخدام معيار تكنولوجيا الخلية بأكملها. وهو يتضمن صورا للخلايا العصبية وصفت GFP شوهدت أثناء التسجيل.

Abstract

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح إجراءات عزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل من الخلايا العصبية واحدة. نبدأ بوصف حل تشريح والاستيلاء على الإناث البالغات المستخدمة في دراستنا. ويتضح هذا الإجراء لإزالة الدماغ كله سليمة ، بما في ذلك كل من الفصوص البصرية. ويرد أيضا تشريح القصبة الهوائية الفوقية. الدماغ معزولة ليس فقط صغير ولكن يحتاج إلى عناية خاصة في التعامل في هذه المرحلة لمنع تلف الخلايا العصبية ، وكثير منها بالقرب من السطح الخارجي للنسيج. نظهر كيف يتم استخدام حامل الخاصة التي قمنا بتطويرها لتحقيق الاستقرار في الدماغ في غرفة تسجيل. تشكيل لالكهربية هو معيار يستخدم للحصول على تسجيل واحد من الخلايا العصبية أو أزواج من الخلايا العصبية. صورة الفلورسنت ، وينظر من خلال المجهر التسجيل ، من خط القيادة GAL4 GFP التعبير (GH146) يوضح كيف يتم تحديد الخلايا العصبية الإسقاط (PNS) في الدماغ حية. صورة رفيع Nomarski الطاقة يظهر عرض للعصبون واحد هو استهداف لتسجيل الخلية بأكملها. عندما تتم إزالة بنجاح دون ضرر في الدماغ ، والغالبية العظمى من الخلايا العصبية نشطة بشكل عفوي ، إطلاق إمكانات العمل و / أو العارضة مدخلات متشابك عفوية. هذا في إعداد الموقع ، والتي يمكن الجمع بين كل خلية من الخلايا العصبية تسجيل المحددة في الدماغ كله مع التلاعب الجيني والدوائي ، هو نموذج مفيدة لاستكشاف الفيزيولوجيا الخلوية واللدونة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين.

Protocol

أولا تشريح أدمغة البالغين من الطيران

1. وضع قطرة صغيرة (~ 100 ميكرولتر) للتشريح في حل وسط طبق بيتري 35 مم.
2. الصيد البالغات باستخدام الشافطة. تحت المجهر تشريح ، واستخدام إبر المحاقن اثنين إلى قطع رأس ذبابة.
3. رئيس المركز في قطرة صغيرة من المياه المالحة تشريح (مع غراء المضافة) في طبق بتري.
4. رئيس المركز مع مع خرطوم التي تواجه قاع الطبق.
5. عقد إهاب المركب الذي يغطي العين اليسرى مع إبرة 1. اجراء خفض قطري التي تمتد من الظهرية الى السطح البطني مع إبرة 2 ، الإنسية لمجرد إبرة 1.
6. مع الاستمرار على فمها واستخدام إبرة 1 إبرة 2 الى اجراء خفض الأفقي الذي يمتد من السطح البطني من العين اليسرى إلى العين اليمنى ، على مستوى القاعدة من خرطوم.
7. عقد إهاب المركب الذي يغطي العين اليمنى مع إبرة 1. اجراء خفض قطري التي تمتد من الظهرية الى السطح البطني مع إبرة 2 ، الإنسي فقط من إبرة 1.
8. استدارة الرأس بحيث الجانب منقاري على سطح طبق بتري. ادخال ابرة 1 بين جليدة منقاري والدماغ ، واستخدام إبر 2 لمتابعة مسار نفس الإبرة الأولى. من الناحية المثالية ، سوف تكون الكبسولة قشر بعيدا عن الدماغ مع كل من الفصوص البصرية منذ تولي هذه المهمة في تحقيق الاستقرار في الدماغ للتسجيل.
9. تتم إزالة بعناية القصبة الهوائية والحويصلات الهوائية ، وغيرها من الأنسجة الضامة باستخدام اثنين ملقط غيض الغرامة.
10. يجب تشريح كامل يستغرق 3-10 دقائق

II. تركيب الجهاز العصبي المركزي

1. يتم نقل الدماغ إلى غرفة تسجيل باستخدام الماصة غيض الصفراء.
2. في غرفة التسجيل ، واستقرت في الدماغ عن طريق وضع مثل هذا الإطار أن اثنين من البلاتين عبر الشعر الجميلة التي تجعل الاتصال مع الأنسجة عند تقاطع بين الفصوص البصرية والمنطقة المركزية في المخ.
3. يسمح لكل الدماغ الى الراحة في غرفة مع تسجيل مستمر مع نضح المياه المالحة الاوكسيجين (95 ٪ أكسجين و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) ما لا يقل عن 10 دقائق. هو استمرار التروية للغرفة مع الاوكسيجين المالحة طوال فترة التسجيل. هو إعداد تصور باستخدام المجهر تستقيم (Axioskop 2FS ؛ زايس ، Oberkochen ، ألمانيا) مع مرحلة ثابتة وغمر المياه 40X الهدف (Achroplan ؛ الفتحة العددية ، 0.8 ؛ زايس) والبصريات Nomarski. واعتبر GFP مع فلتر BP مضان 505-530.

III. الكهربية

1. وتستخدم Pipets من 8-14 Mohms للتسجيلات خلية كاملة
2. تجرى التسجيلات الجاري المشبك المشبك والجهد التي تستخدم قائمة EPC7 أو مضخم Axopatch 200B ، وهو 1322A Digidata DA المحول (الأجهزة الجزيئية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) ، وهو البعد ديل 8200 الكمبيوتر (ديل كمبيوتر ، جولة الصخرة ، تكساس) ، وpClamp 9 البرمجيات (الأجهزة الجزيئية).

Discussion

المعزولة إعداد الدماغ كله نوضح في هذا الفيديو يسمح تقييم الآليات الخلوية الكامنة وراء استثارة ونقل متشابك في الخلايا العصبية التي تم تحديدها ، بما في ذلك تلك الموجودة في مسارات معالجة حاسة الشم في الدماغ ذبابة الفاكهة الكبار (ودود يا قو ، 2006). هذا النهج هو مكمل لدراسة نشاط الخلا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices