Yetişkin Drosophila Beyin Tüm Hücre Kayıtlar

Özet

Bu video standart tüm hücre teknolojisini kullanarak tek nöronlar kayıt için hazırlık yetişkin Drosophila tüm beyinleri izole etmek için prosedürü göstermektedir. Bu kayıt sırasında görüntülenen GFP etiketli hücreleri ve nöronlar görüntülerini içerir.

Özet

Bu video, tek bir nöron kayıt için hazırlık yetişkin Drosophila tüm beyinleri izole etmek için prosedürü göstermektedir. Biz diseksiyon çözüm ve çalışmalarda kullanılan yetişkin dişiler yakalama anlatarak başlar. , Hem de optik loblar da dahil olmak üzere, bütün beyin sağlam kaldırarak için prosedür gösterilmiştir. Üstteki trakea Diseksiyon de gösterilir. Izole beyin sadece küçük değil, ama bu aşamada ele nöronlara zarar görmesini önlemek için özel bakım ihtiyacı olan birçok dokusunun dış yüzeyine yakın. Biz, bizim geliştirdiğimiz özel bir tutucu kayıt odasında beyin stabilize etmek için nasıl kullanıldığını gösteriyor. Standart bir elektrofizyoloji kadar, tek bir nöron nöron veya çift kayıt için kullanılır. Bir floresan görüntü kayıt mikroskobu (GH146) projeksiyon nöronları (PNS) canlı beyinde nasıl tanımlanır göstermektedir GFP ifade sürüş GAL4 hattı üzerinden izlenebilmektedir. Yüksek güç Nomarski görüntü tüm hücre kayıt için hedeflenen tek bir nöronun bir görünümdür. Beynin zarar vermeden başarılı bir şekilde kaldırıldığı zaman, nöronların çoğunluğu aksiyon potansiyelleri ve / ateş veya kendiliğinden sinaptik giriş sergileyerek, kendiliğinden aktif. Bu, tüm beyin tespit nöronları tam hücre kayıt farmakolojik ve genetik manipülasyonlar ile kombine edilebilir hangi yerinde hazırlanması, yetişkin MSS hücresel fizyolojisi ve plastisite keşfetmek için yararlı bir model.

Protokol

Erişkin sinek I. beyin Diseksiyon

1. 35 mm Petri kabında merkezi çözüm diseksiyon küçük bir damla (~ 100 ul) yerleştirin.
2. Aspiratörü kullanarak yetişkin dişi yakalayın. Diseksiyon mikroskobu altında, sinek başını kesmek için iki şırınga iğneleri kullanın.
3. Petri kabındaki tuzlu su diseksiyon küçük bir damla (papain eklenmiş) yerleştirin baş.
4. Çanak alt bakan burnumun ile pozisyon kafa.
5. 1 iğne ile sol bileşik göz kapsayan manikür tutun. 2, sadece 1 iğne medial iğne ile ventral dorsal uzanan diyagonal bir kesim olun.
6. 1 iğne ile ağız tutun ve iğne 2 burnumun temel seviyesinde, sağ göz sol göz ventral uzanan yatay bir kesim yapmak için kullanabilirsiniz.
7. 1 iğne ile doğru bileşik göz kapsayan manikür tutun. Iğne 2, iğne 1 sadece medial dorsal ventral yüzeyine uzanan bir çapraz kesim olun.
8. Rostral tarafında Petri kabı yüzeyinde böylece baş döndürün. Rostral manikür ve beyin arasındaki yerleştirin, iğne 1 ve iğne 2 kullanmak ilk iğne olarak aynı yolu takip etmek. İdeal olarak, kapsül, kayıt için beyin stabilize önemli olan bu yana bağlı iki optik loblar ile beyin kabuğu olacaktır.
9. Trakea, hava kesesi ve diğer bağ dokuları dikkatle iki ince uçlu forseps kullanarak kaldırılır.
10. Tüm diseksiyonu 3-10 dakika sürer

II. MSS Montaj

1. Beyin sarı bir ucu pipetlemeyin kullanarak kayıt odasına aktarılır.
2. Kayıt odasına, beyin, iki ince çapraz kıllar, optik loblar ve merkezi beyin bölgesi arasındaki kavşakta doku ile temas kurmaya platin çerçeve koyarak stabilize edilir.
3. Her beyin oksijenli tuzlu su ile sürekli perfüzyon (% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit) en az 10 dakika süreyle kayıt odasında dinlenmek için izin verilir. Oksijenli salin ile odasının Perfüzyon kayıt dönemi boyunca devam eder. Ve Nomarski optik sabit bir sahne ve 40x suya daldırma hedefi (; sayısal diyafram, 0.8 Zeiss Achroplan); Hazırlık dik bir mikroskobu (Zeiss, Oberkochen, Almanya Axioskop 2FS) kullanılarak görüntülenmiştir. GFP BP 505-530 floresan filtre ile görüntülenebilir.

III. Elektrofizyoloji

1. 8-14 Mohms pipetleri tüm hücre kayıtları için kullanılır.
2. Akım-kelepçe ve voltaj-klemp kayıtları Listesi EPC7 veya Axopatch 200B amplifikatör, Digidata 1322A DA dönüştürücü (Moleküler Aygıtlar, Foster City, CA), bir Dell Dimension 8200 bilgisayar (Dell Computer, Round Rock, Teksas), kullanılarak yapılmaktadır ve 9 yazılımı (Moleküler Aygıtları) pClamp.

Tartışmalar

Bu video göstermek izole tüm beyin hazırlama uyarılabilirlik ve yetişkin Drosophila beyin (Gu ve O Dowd, 2006), koku işleme yolları da dahil olmak üzere tespit nöronlar, sinaptik iletim altında yatan hücresel mekanizmaları değerlendirme sağlar. Bu yaklaşım, uyanık davranmak memeliler kayıtları tamamlayıcı memeli bir beyin dilim nöronların kadar aynı şekilde kayıtları, bozulmamış yetişkin Drosophila (Wilson ve ark 2004) beyindeki nöronal aktivitenin çalışma tamamlayıcı. Memeli dilimlerine göre yerinde sin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices