Registrazioni cella intero cervello di adulti Drosophila

Riepilogo

Questo video mostra la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione di singoli neuroni utilizzando tecnologia standard a cellula intera. Esso comprende le immagini di cellule GFP etichettati e neuroni visualizzati durante la registrazione.

Abstract

In questo video, dimostriamo la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione da singoli neuroni. Cominciamo con la descrizione della soluzione di dissezione e la cattura delle femmine adulte utilizzate nei nostri studi. La procedura per la rimozione del cervello intatto, tra cui entrambi i lobi ottici, è illustrata. Dissezione della trachea sovrastante è anche mostrato. Il cervello isolato non è solo piccola ma necessita di particolare attenzione nella gestione in questa fase, per evitare di danneggiare i neuroni, molti dei quali sono vicini alla superficie esterna del tessuto. Si mostra come un supporto speciale che abbiamo sviluppato è usato per stabilizzare il cervello nella camera di registrazione. Un elettrofisiologia norme stabilite viene utilizzato per la registrazione di singoli neuroni o coppie di neuroni. Una immagine fluorescente, vista attraverso il microscopio di registrazione, da una linea guida GAL4 espressione GFP (GH146) illustra come i neuroni di proiezione (PN) sono identificate nel cervello vivo. Una immagine ad alta potenza Nomarski mostra una vista di un singolo neurone che è nel mirino per la registrazione a cellula intera. Quando il cervello è rimosso con successo senza danni, la maggior parte dei neuroni sono attivi spontaneamente, sparando potenziali d'azione e / o esporre spontaneo di input sinaptici. Questo in preparazione in situ, in cui la registrazione a cellule intere di neuroni identificati in tutto il cervello può essere combinato con manipolazioni genetiche e farmacologiche, è un modello utile per esplorare la fisiologia cellulare e la plasticità del sistema nervoso centrale adulto.

Protocollo

I. La dissezione del cervello da mosca adulta

1. Mettere una piccola goccia (~ 100 l) di dissezione soluzione in centro di un piatto 35 millimetri Petri.
2. Cattura femmina adulta con aspiratore. Sotto dissezione microscopio, utilizzare due aghi da siringa di decapitare la mosca.
3. Mettere la testa in una piccola goccia di soluzione salina dissezione (con papaina aggiunto) in una capsula di Petri.
4. Testa di posizione con con proboscide rivolta fondo del piatto.
5. Tenere la cuticola che copre l'occhio sinistro composto con ago 1. Fare un taglio diagonale che si estende dalla dorsale verso la superficie ventrale con ago 2, proprio mediale ago 1.
6. Tenere l'apparato boccale con l'ago 1 e usare l'ago 2 per fare un taglio orizzontale che si estende dalla superficie ventrale dell'occhio sinistro per l'occhio destro, a livello della base della proboscide.
7. Tenere la cuticola che copre l'occhio destro compound con ago 1. Fare un taglio diagonale che si estende dalla dorsale verso la superficie ventrale con ago 2, proprio mediale dell'ago 1.
8. Ruotare la testa in modo che la parte rostrale è sulla superficie del piatto di Petri. Inserire l'ago 1 tra la cuticola rostrale e il cervello, e usare l'ago da 2 a seguire lo stesso percorso del primo ago. Idealmente, la capsula sarà staccarsi dal cervello con entrambi i lobi ottici collegati in quanto questi sono importanti per stabilizzare il cervello per la registrazione.
9. La trachea, l'aria sacche, e altri tessuti connettivi sono accuratamente rimossi con due pinze punta fine.
10. Dissezione tutto dovrebbe prendere 3-10 minuti

II. Montaggio del sistema nervoso centrale

1. Il cervello è trasferita nella camera di registrazione usando una pipetta gialla punta.
2. Nella camera di registrazione, il cervello è stabilizzato posizionando il telaio platino tale che due mirino bene mettersi in contatto con il tessuto a livello della giunzione tra i lobi ottici e la regione del cervello centrale.
3. Ogni cervello si lascia riposare in camera di registrazione con perfusione continua con soluzione fisiologica ossigenata (95% di ossigeno e anidride carbonica del 5%) per almeno 10 minuti. Perfusione della camera con soluzione fisiologica ossigenata è proseguito per tutto il periodo di registrazione. La preparazione è visualizzata utilizzando un microscopio in posizione verticale (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Germania) con un palco fisso e un obiettivo 40x immersione in acqua (Achroplan, apertura numerica, 0,8; Zeiss) e l'ottica Nomarski. GFP è stato visto con una pressione arteriosa 505-530 fluorescenza filtro.

III. Elettrofisiologia

1. Pipette di 8-14 Mohm sono usati per le registrazioni a cellula intera
2. Current-clamp e voltage-clamp registrazioni vengono eseguite utilizzando un elenco EPC7 o un amplificatore Axopatch 200B, un Digidata 1322A convertitore DA (Molecular Devices, Foster City, CA), un Dell Dimension 8200 computer (Dell Computer, Round Rock, TX), e pClamp 9 software (Molecular Devices).

Discussione

La preparazione isolato intero cervello illustriamo in questo video permette la valutazione dei meccanismi cellulari alla base eccitabilità e la trasmissione sinaptica nei neuroni identificati, compresi quelli nelle vie di elaborazione olfattiva, nel cervello adulto Drosophila (Gu e O Dowd, 2006). Questo approccio è complementare allo studio dell'attività neuronale nel cervello degli adulti Drosophila intatto (Wilson et all 2004), più o meno allo stesso modo le registrazioni da parte dei neuroni in una fetta cervello dei mammiferi s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices