성인 Drosophila의 머리에서 전체 셀 레코딩

요약

이 비디오는 표준 전체 세포 기술을 사용하여 하나의 뉴런에서 레코딩을위한 준비 성인 Drosophila의 전체 머리를 분리하는 절차를 보여줍니다. 그것은 녹음하는 동안 많이 GFP 라벨 세포와 뉴런의 이미지가 포함되어 있습니다.

초록

이 비디오에서는, 우리는 하나의 뉴런에서 레코딩을위한 준비 성인 Drosophila의 전체 머리를 분리하는 절차를 보여줍니다. 우리는 해부 솔루션 및 우리의 연구에 사용되는 성인 여성의 캡처를 설명하여 시작합니다. 두 광 엽 (叶)을 포함하여 전체 두뇌 손상 제거하는 절차는 그림입니다. overlying의 기관의 해부도 표시됩니다. 고립된 두뇌는 작은뿐만 아니라하지만 뉴런의 손상을 방지하려면이 단계에서 취급에 특별한주의가 필요하는 많은 조직의 외부 표면 가까이에 있습니다. 우리가 개발한 특별한 소유자가 기록 챔버의 머리를 안정화하는 데 사용됩니다 방법을 보여줍니다. 표준 전기 생리학 최대가 뉴런의 단일 뉴런 또는 쌍의 기록에 사용됩니다 설정할 수 있습니다. (GH146) 프로젝션 뉴런 (PNS)가 살아있는 두뇌에 식별하는 방법을 보여줍니다 GFP 표현 운전 GAL4 라인에서 녹음 현미경을 통해 본 형광 이미지. 고전력 Nomarski 이미지는 전체 세포 녹음 대상으로되고 단일 신경 세포의보기를 표시합니다. 두뇌가 성공적으로 손상없이 제거되면, 뉴런의 대부분은 작업 잠재력 및 / 해고 또는 자발적인 시냅스 입력을 전시, 자발적으로 활성화됩니다. 전체 뇌 뉴런에서 확인된 전체 휴대폰 녹음이 유전 및 약리 조작과 조합하여 사용할 수있는 현장 준비에 이것은 성인 CNS의 세포 생리와 소성을 탐험에 유용한 모델입니다.

프로토콜

성인 파리에서 두뇌의 I.의 해부

1. 35mm 페트리 접시의 중앙에 솔루션을 해부의 작은 방울 (~ 100 μl)을 놓으십시오.
2. 흡인기를 사용하여 성인 여성을 관람해보세요. 현미경을 해부에서 날아 목을 벨 두 주사기의 바늘을 사용합니다.
3. 배양 접시에있는 해부 생리의 작은 방울 (papain가 추가로)에 플레이스 머리.
4. 접시의 바닥을 마주 코와 함께 위치 머리.
5. 바늘 1 왼쪽 화합물 눈을 덮고있는 표피를 잡아. 바늘 1 단지 중간 바늘 2와 복부 표면에 지느러미에서 확장하는 대각선 절단하십시오.
6. 바늘 1 mouthparts 잡고 코의 기지의 수준, 오른쪽 눈 왼쪽 눈의 복부 표면에서 확장 수평 절단을하기 위해 바늘이 2를 사용합니다.
7. 바늘 1 오른쪽 화합물 눈을 덮고있는 표피를 잡아. 바늘 1 단지 중간 바늘 2와 복부 표면에 지느러미에서 확장하는 대각선 절단하십시오.
8. 주동이의 측면은 페트리 접시의 표면에 수 있도록 머리를 회전합니다. 주동이의 표피와 뇌 사이의 바늘 1을 삽입하고, 첫 번째 바늘과 같은 경로를 따라 바늘이 2를 사용합니다. 이상적으로, 캡슐은 레코딩을위한 두뇌 안정화에 중요한 떨어진이 때문에 연결된 두 광 엽 (叶)으로 두뇌의 껍질됩니다.
9. 기관, 공기 주머 니나, 기타 결합 조직은 신중하게이 멋진 팁 집게를 사용하여 제거됩니다.
10. 전체 해부는 30~10분을 취하

II. CNS를 장착

1. 두뇌는 노란색 팁 pipet을 사용하여 녹음 챔버로 전송됩니다.
2. 레코딩 챔버에서 뇌의 두 고급 크로스 머리카락이 광 엽 (叶) 및 중앙 두뇌 지역 사이의 교차점에있는 조직과의 접촉을 이러한 플래티넘 프레임을 배치하여 안정화됩니다.
3. 각각의 두뇌는 적어도 10 분 동안 산소 식염수에 지속적인 관류 (95 % 산소와 5 % 이산화탄소)와 녹화 실에서 휴식을 허용합니다. 산소 생리와 챔버의 재관류는 녹음 기간 내내 계속됩니다. 그리고 Nomarski 광학 고정된 무대와 40x 물 침지 목표 (;, 수치 조리개, 0.8 자이스 혈구 Achroplan)로, 준비는 직립 현미경 (자이스 혈구, Oberkochen, 독일 Axioskop 2FS)를 사용하여 시각입니다. GFP는 BP 505-530 형광 필터를 조회했다.

III. 전기 생리학

1. 8-14 Mohms의 Pipets는 전체 세포 레코딩에 사용됩니다
2. 전류 클램프 및 전압 - 클램프 녹음 목록 EPC7 또는 Axopatch 200B 증폭기, Digidata 1322A DA 컨버터 (분자 디바이스, 포스터 시티, CA), 델 디멘션 8200 컴퓨터를 (델 컴퓨터, 라운드 록, TX), 사용하고 수행됩니다 9 소프트웨어 (분자 장치) pClamp.

토론

우리는이 동영상에서 보여주는 고립 전체 뇌 준비 흥분과 성인 Drosophila 두뇌 (특별시 및 O 다우드, 2006)에서 후각 처리 경로에 해당 포함한 식별 뉴런에서 신경 전달 기본 세포 메커니즘의 평가를하실 수 있습니다. 이 방법은 깨어있는 행동 포유류에서 녹음을 보완하는 포유류의 뇌 슬라이스의 뉴런에서 많은 동일한 방식으로 녹음에 손상 성인 Drosophila (윌슨 동부 표준시 모든 2004)의 두뇌에의 연결 활동 연구 보완...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices