Всего записей сотовый от мозга взрослого дрозофилы

Резюме

Это видео демонстрирует процедуру выделения весь мозг от взрослых дрозофил при подготовке к записи от отдельных нейронов с использованием стандартных технологий целом клетки. Она включает в себя образы GFP меченых клеток и нейронов рассматриваться во время записи.

Аннотация

В этом видео мы продемонстрируем процедуру выделения весь мозг от взрослых дрозофил при подготовке к записи от отдельных нейронов. Мы начнем с описания рассекает решение и захвата взрослые самки, используемые в наших исследованиях. Процедура снятия весь мозг неповрежденным, в том числе и оптических долях, проиллюстрировано. Препарирование вышележащих трахеи также показано на рисунке. Изолированных мозг не только малой, но нуждается в особом уходе в обработке на данном этапе, чтобы предотвратить повреждение нейронов, многие из которых близки к внешней поверхности ткани. Мы покажем, как специальный держатель мы разработали для стабилизации мозга в записи камеры. Стандартный электрофизиологии создали используется для записи с отдельных нейронов или пары нейронов. Флуоресцентные изображения, рассматривается через микроскоп записи, от GAL4 линии вождения GFP выражение (GH146) показывает, как проекционных нейронов (PNS) отмечены в живой мозг. Высокая мощность Номарского изображение показывает зрения одного нейрона, которые преследуют за весь записи клетки. Когда мозг успешно удален без повреждения, большинство нейронов спонтанно активных, выпустив потенциалов действия и / или экспонирование спонтанных синаптических входа. Это, в месте подготовки, в котором все записи ячейки определили нейронов в мозг целиком могут быть объединены с генетических и фармакологических манипуляций, является полезной моделью для изучения клеточной физиологии и пластичность во взрослой ЦНС.

протокол

I. Препарирование мозга от взрослых летать

1. Нанесите небольшое снижение (~ 100 мкл) рассекает решение в центре 35 мм чашки Петри.
2. Поймать взрослую самку использовании аспиратора. Под микроскопом рассекает, используйте две иглы шприца обезглавить летать.
3. Место голову в небольшую каплю рассекает физиологического раствора (папаин с нами) в чашке Петри.
4. Позиция головы с хоботком перед нижней части блюда.
5. Держите кутикулы покрытие левого глаза соединения с иглой 1. Сделать диагональные вырезать, которая простирается от спинной к брюшной поверхности с иглой 2, просто медиальнее иглы 1.
6. Держите ротовые с иглой 1 и использования иглы 2, чтобы сделать горизонтальный разрез, который простирается от брюшной поверхности левым глазом в правый глаз, на уровне основания хоботка.
7. Держите кутикулы покрытие правого глаза соединения с иглой 1. Сделать диагональные вырезать, которая простирается от спинной к брюшной поверхности с иглой 2, только медиальной иглы 1.
8. Повернуть голову так, чтобы ростральной сторона лежит на поверхности чашки Петри. Вставьте иглу 1 между ростральной кутикулы и головного мозга, а также использовать иглу от 2 до следуют тем же путем, что и первый иглу. В идеале, капсула будет кожуру от мозга с обеих оптических долях прилагается так как они имеют важное значение в стабилизации мозга для записи.
9. Трахеи, воздушные мешки, и других соединительных тканей, тщательно удаляют с помощью двух прекрасных щипцы чаевые.
10. Всего вскрытие должно 3-10 минут

II. Монтаж ЦНС

1. Мозг переходит к записи камеры использованием желтого пипетки чаевые.
2. В записи камеры, мозг стабилизируется путем размещения платины кадр так, что два прекрасных волос крест в контакт с тканью на стыке между оптическими доли и центральной области мозга.
3. Каждый мозг имеет право отдыхать в записи камеры с непрерывной перфузии с кислородом солевой (95% кислорода и 5% углекислого газа), по крайней мере 10 минут. Перфузии камере с кислородом физиологического раствора продолжалась в течение периода записи. Подготовка визуализируется использованием прямой микроскоп (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Германия) с фиксированной сцене и 40x цель погружения воды (Achroplan; числовой апертурой, 0,8; Zeiss) и Номарского оптики. GFP был просмотрен с БП 505-530 флуоресценции фильтр.

III. Электрофизиология

1. Пипец в 8-14 МОм используются для записи целого клетка
2. Текущий зажим и напряжения зажим записи выполняются с помощью Список EPC7 или Axopatch 200B усилитель, DIGIDATA 1322A цифро-аналоговый преобразователь (Molecular Devices, Foster City, CA), Dell Dimension 8200 компьютеров (Dell Computer, Раунд-Рок, штат Техас), и pClamp 9 программное обеспечение (Molecular Devices).

Обсуждение

Изолированных целом подготовка мозга мы проиллюстрируем в этом видео позволяет оценить сотовой механизмы, лежащие возбудимости и синаптической передачи в выявленных нейронов, в том числе в обонятельных путей обработки, во взрослом мозге дрозофилы (Gu и О Дауд, 2006). Такой подход является дополните?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 Foceps	Tool	Fine Science Tools	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington Biochemical	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon Instruments		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Carl Zeiss, Inc.		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular Devices
Digidata D-A converter	1322A	Molecular Devices