Luciferase به لالتهابات جرثومية في صورة الفئران

Summary

يتم وصف أساليب التصوير تلألؤ بيولوجي من الالتهابات البكتيرية في الحيوانات الحية. يتم تعديل في التعبير عن مسببات الأمراض luciferase التصوير الضوئي السماح الجسم كله من الإصابات في الحيوانات الحية. يمكن أن يصاب النماذج الحيوانية مع التعبير عن مسببات الأمراض luciferase وبطبيعة الحال ينجم عن ذلك من تصور المرض في الوقت الحقيقي من خلال التصوير تلألؤ بيولوجي.

Abstract

التصوير هو أسلوب القيمة التي يمكن استخدامها لمراقبة العمليات البيولوجية. على وجه الخصوص ، يمكن تتبع وجود الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية ، والخلايا المناعية أنواع محددة ، ومسببات الأمراض الفيروسية ، والطفيليات والبكتيريا في الوقت الحقيقي داخل الحيوانات الحية ^1-2. تطبيق التصوير تلألؤ بيولوجي لدراسة مسببات الأمراض ومزايا مقارنة الاستراتيجيات التقليدية لتحليل الإصابات في النماذج الحيوانية ^3-4. ويمكن تصور أن تكون العدوى داخل الحيوانات الفردية على مر الزمن ، دون اشتراط القتل الرحيم لتحديد مكان وكمية من العامل الممرض. التصوير الضوئي يتيح فحص شامل لجميع الأنسجة والأعضاء ، بدلا من أخذ العينات من المواقع المعروفة سابقا لتكون مصابة. بالإضافة ، يمكن من دقة التلقيح في أنسجة معينة تحدد مباشرة قبل القيام الحيوانات إلى الأمام التي تم تلقيح دون جدوى طوال التجربة بأكملها. يمكن التحكم عن التباين بين الحيوانات ، منذ التصوير يسمح الواجب اتباعها كل حيوان على حدة. التصوير لديه القدرة على الحد بشكل كبير من أعداد الحيوانات التي يحتاجون إليها بسبب القدرة على الحصول على بيانات من العديد من النقاط الزمنية دون الحاجة إلى الأنسجة العينة لتحديد الحمولة الممرض ^3-4.

يصف هذا البروتوكول لتصور طرق العدوى في الحيوانات الحية باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي لسلالات من البكتيريا معربا عن المؤتلف luciferase. الخنفساء فوق (CBRLuc) وluciferases يراعة (FFluc) الاستفادة luciferin باعتبارها الركيزة ^5-6. ضوء على حد سواء التي تنتجها وCBRluc FFluc وطول موجة واسعة من 500 نانومتر إلى 700 نانومتر ، مما يجعل هذه luciferases صحفيين ممتازة للتصوير الضوئي في النماذج الحيوانية الحية ^7-9. هذا هو في المقام الأول لأن هناك حاجة موجات الضوء أكبر من 600 نانومتر لتجنب امتصاص الهيموغلوبين ، وبالتالي ، والسفر من خلال أنسجة الثدييات بكفاءة. هو عرض وراثيا Luciferase في البكتيريا لإنتاج إشارة ضوئية ^10. يتم تلقيح الفئران الرئوي مع البكتيريا bioluminescent intratracheally للسماح للرصد العدوى في الوقت الحقيقي. بعد الحقن luciferin ، يتم الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير IVIS. خلال التصوير ، ويتم تخدير الفئران مع isoflurane باستخدام نظام XGI - 8 Anethesia الغاز. ويمكن تحليل الصور لتوطين وتحديد مصدر إشارة ، والذي يمثل موقع عدوى بكتيرية (ق) والرقم ، على التوالي. بعد التصوير ، ويتم تحديد CFU خارجا على النسيج المتجانس للتأكد من وجود البكتيريا. وتستخدم عدة جرعات من الجراثيم البكتيرية لربط الأرقام مع التألق. ويمكن تطبيق التصوير لدراسة تطور المرض وتقييم فعالية مركبات مضادة للجراثيم واللقاحات.

Protocol

1. العدوى الرئوية التي التنبيب داخل الرغامى

1. وزن الفئران ، واختياريا ، يمكن جعل علامات على أذنيه لتحديد سهلة.
2. تخدير الفئران مع الكيتامين (100 ميكروغرام لكل غرام من وزن الماوس) ، وزيلازين (10 ميكروغرام لكل غرام من وزن الفأر) بواسطة التلقيح داخل الصفاق.
3. مكان الفئران في اقفاص حتى تخدير كامل. ضغط على منصات أقدامهم لفحص دواسة المنعكس. يجب أن تعرض الفئران انخفاض أو أي رد فعل منعكس.
4. ضع الماوس على الوقوف التنبيب ملقاة على ظهرها.
5. إصلاح الشريط المطاطي على الوقوف التنبيب ومكان فإنه في ظل القواطع العلوية من الفأرة. استخدام الشريط لإصلاح الساقين والذراعين على موقف التنبيب.
6. تحرك بلطف tougue يخرج من الفم باستخدام ملقط.
7. ادخال منظار مع octoscope داخل الفم والبلعوم حتى تنظر في فتح الحنجرة مرئيا.
8. تقدم الأسلاك دليل مغطاة cathether في القصبة الهوائية حتى وصل catether هو في القواطع. إزالة الأسلاك الدليل. وضعت في الهواء للاحتفال cathether توسيع الصدر وتأكيد التنبيب الصحيح.
9. ضخ 50 ميكرولتر من البكتيريا (في الصور المبينة كنا عصية كالميت غيران (BCG) معربا عن خنفساء فوق الحمراء luciferase (CBRLuc) ، شيدت في المختبر لدينا ، ولكن يمكن استخدام أي الانارة سلالة بكتيرية) حل من خلال cathether باستخدام حقنة 1 مل.
10. مكان الماوس في قفص ونلاحظ أنه خلال التعافي من التخدير.

2. التخدير الحيوانية والتحضير لتصوير ضوء بارد

الفئران هي تخدير مع isoflurane باستخدام نظام XGI - 8 Aneshesia الغاز.

1. قبل تشغيل نظام XGI - 8 التخدير ، وتزن كل علبة الفحم التصفية وكتابة الوزن والتاريخ على ذلك. إذا كان الوزن أكثر من 50 غرام من الوزن الأولي ، استبداله اسطوانة جديدة.
2. تحقق من مستوى isoflurane في المرذاذ وملئه إذا لزم الأمر.
3. بدوره على مضخة الإجلاء في الجزء الأمامي من XGI - 8 نظام التخدير وتعيين إلى 8 LPM (ليتر لكل minuite).
4. بدوره على امدادات الاوكسجين من أسطوانات الضغط العالي وتعيينه إلى 55 رطل لكل بوصة مربعة.
5. بدوره على الأكسجين تبديل (الأخضر) على الجزء الأمامي من التخدير XGI - 8 النظام.
6. بدوره على تدفق الغاز الى غرفة التصوير لضبط مستوى تدفق الغاز. تعيين إلى 0.25 LPM ثم إيقاف تدفق الغاز.
7. بدوره على تدفق الغاز إلى غرفة التخدير التعريفي لضبط مستوى تدفق الغاز. تعيين إلى 1.5 LPM ثم إيقاف تدفق الغاز.
8. بدوره على isoflurane مع المرذاذ وتعيين إلى 2-2،5 في المئة. يمكن ضبط مستوى isoflurane تبعا لعدد الحيوانات المستخدمة والوزن.
9. مكان الفئران الى غرفة الاستقراء وإغلاق الغطاء. بدوره على تدفق الغاز الى حجرة التعريفي. الفئران مكان في الغرفة لمدة 5 -- 10 minuites حتى يتم تخدير كامل.
10. تطبيق مرهم البصرية للعين لحماية عينيه أثناء التصوير الماوس ووضع الفئران في غرفة التصوير في واحدة من المخاريط على الأنف مشعب التخدير. استخدام الضوء يربك بين الفئران لمنع انعكاس الضوء على الموضوعات الحيوان المجاورة.
11. حقن luciferin (150 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) عن طريق التلقيح داخل الصفاق.

3. تلألؤ بيولوجي التصوير

1. بدء برامج التصوير الحي.
2. إذا لم يتم تهيئة النظام ، وتهيئة نظام التصوير IVIS.
3. تعيين المعلمات من أجل التصوير بالنقر الإعداد تسلسل في اقتناء IVIS لوحة التحكم.
   حدد التلألؤ وصورة في وضع التصوير. إذا كان الخيار هو المطلوب لتنفيذ إعادة الإعمار DLIT 3D ، حدد الصور الفوتوغرافية الضوء ، الانارة والهيكلية كجزء من تسلسل الصور.
   تعيين وقت التعرض من 0.5 ثانية لمدة 10 دقائق.
   تعيين Binning وF / وقف استنادا سطوع المتوقع من العينة.
   تعيين مرشح لمنع الإثارة وانبعاث تصفية لفتح ، ما لم تخطط للحصول على موجات معينة فقط من الضوء. في حالة DLIT 3D الدستور ، وتعيين المرشحات انبعاث موجات متعددة من مختلف دقيقة للسماح للتوطين من المصدر.
   تعيين FOV من ألف إلى دال اعتمادا على عدد من الفئران أو الحيوانات لمنطقة يمكن تصوير. حدد A و B : 1 الماوس ، C الفئران لمدة 2-3 ، 4-5 و D عن الفئران.
4. انقر فوق إضافة في معالج الصور في اقتناء لوحة التحكم لإضافة الإعداد التسلسل.
5. تسلسل بدء التصوير عن طريق النقر عليه.
   في حالة البناء 3D DLIT ، سيتم الحصول على الصور الانارة للمرشحات متعددة في انبعاث موجات مختلفة. وسيتم أيضا الصور الفوتوغرافية ومنظم الخفيفة سيتم شراؤها.
6. خلال اقتناء والصورة وتحرير الصور المستويات لوحات تكون مرئية. تعبئة على معلومات مفصلة قدر الإمكان عن كل تجربة في تحرير الصورة لضمان سهولة تتبع الصور في أوقات لاحقة وحفظ الصور.
7. ReRemove الفئران من IVIS غرفة التصوير وإعادتها إلى أقفاصها. نلاحظ من الانتعاشلم تكن لضمان حس الفئران تتأثر كثيرا الإجراء. يجب مراقبة الحيوانات باستمرار حتى يتعافى تماما من التخدير (عادة 1-2 دقائق).

4. التصوير وخارج الحي CFU التحليل الكمي للمن البكتيريا في الرئتين

1. حقن الفئران مع intraperitoneally luciferin بالطريقة نفسها للتصوير ، وذلك قبل لمجرد القتل الرحيم.
2. الموت ببطء في الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من 5 دقائق بعد الحقن pentobarbitol luciferin.
3. يزدرع الرئتين من الفئران ووضعه في الأطباق ، بتري معقمة باستخدام ملقط معقم والمقص.
4. طبق بتري مكان يحتوي الجهاز explanted في غرفة التصوير والحصول على صور في تلألؤ بيولوجي بنفس الطريقة للماوس كلها.
5. بعد التصوير ، وإزالة الجهاز من طبق بتري explanted باستخدام ملقط معقم والتجانس في برنامج تلفزيوني مل 1.
6. جعل التخفيفات والأنسجة لوحة على وسائل الإعلام وانتقائية مناسبة. ويمكن تخزين النسيج المتجانس -80 درجة مئوية لاعادة الطلاء ينبغي أن يكون ذلك ضروريا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام النسيج المتجانس لاستخراج الحمض النووي الريبي أو لتحديد الأرقام التي qPCR البكتيرية.

5. تحليل التصوير التلألؤ

1. بدء "العيش برامج التصوير" وتصفح ملفات الصور.
2. استخدام "لوحة أداة" لضبط الصور. انقر فوق صورة لتعديل ضبط تصحيح / تصفية الإعدادات ودقيقة / كحد أقصى لمقاييس الألوان الفردية.
3. استخدام أدوات في القائمة المنسدلة دوروا لتحديد مقدار شدة الضوء. حدد ROI شكل وعدد وحجم. اسحب الإطار إلى المنطقة ROI الفائدة على الصورة. ضمان جميع ROI هي نفس الحجم والشكل. انقر فوق حفظ وقياس العائد على الاستثمار ، نسخة و / أو تصدير البيانات الكمية.
4. في حالة إعادة البناء DLIT 3D ، تحميل تسلسل الصور بما في ذلك صورة ضوئية منظم. فوق تضاريس السطح في أداة بلات. في القائمة المنسدلة ، انقر فوق علامة التبويب إعادة إعمار لتوليد تضاريس السطح. وهناك فوضى السطح ثم تظهر في النافذة.
5. حدد DLIT إعادة الإعمار في 3D أداة بلات. في القائمة المنسدلة ، انقر فوق علامة التبويب خصائص لتعيين خصائص الأنسجة والطيف المصدر. ينصح العضلات في معظم الظروف. في القائمة المنسدلة ، انقر فوق علامة التبويب تحليل لتحديد الطول الموجي للتحليل. انقر فوق علامة التبويب معلمة وتأكيد القيم الافتراضية أو تعديل المعلمات DLIT إذا لزم الأمر. انقر فوق علامة التبويب لبدء إعادة إعمار تحليل 3D.
6. عندما يتم الانتهاء من إعادة الإعمار 3D ، وسوف ترى 3D عرض نتائج إعادة الإعمار 3D. انقر فوق علامة التبويب لمعرفة النتائج وتحليل البيانات لكثافة الفوتون ، voxels والمعلمات الخوارزمية DLIT.
7. حفظ و / أو تصدير نتائج التحليلات إعادة الإعمار 3D إلى أرقام وملفات البيانات.

6. ممثل النتائج :

وتظهر الصور تلألؤ بيولوجي من الفئران مصابة بالبكتيريا bioluminescent جنبا إلى جنب مع السيطرة الماوس المعافين في الشكل 1. والرئوي الفئران المصابة ببكتيريا bioluminescent تنتج إشارة هامة من الرئتين (الشكل 1). وكميا كثافة التلألؤ والتمويه ضمن مجموع عائدات الاستثمار (منطقة المهتمة) (الشكل 2). هو تطبيع البيانات الكمية لشدة الضوء على الوحدات التي تشكل مستعمرة (CFU) من البكتيريا التي تم الحصول عليها من الرئتين لتأكيد أن يتم إنتاج إشارة من البكتيريا bioluminescent ويمكن مقارنة لمراقبة سلبية. يمكن أن يكون موقع وحدة تحليل الإشارات المزيد من الإعمار 3D DLIT مصدر التلألؤ على أساس التصوير المقطعي لسطح الماوس ^11. تسمح هذه التحليلات الكمي والتوطين للإشارة bioluminescent المنتجة. نتائج إعادة الإعمار 3D مصدر الانارة في الفئران المصابة يوضح أن الضوء ينتج من الرئتين من الفأرة (الشكل 3). ينبعث الصور فيفو السابقين في الرئتين مما يؤكد أن الماوس التلألؤ من الرئتين ، بدلا من بعض الأنسجة الأخرى جنبا إلى جنب بشكل وثيق أو الهيئة (الشكل 2C).

الشكل 1. التصوير التلألؤ من الفئران مصابة بالبكتيريا الرئوية bioluminescent المفتاحية CBRluc. المعافين الماوس السيطرة على الجهة اليسرى واثنين من الفئران المصابة هي على حق. وكانت الفئران مصابة بالبكتيريا معربا عن CBRluc (ن = 2) من طريق داخل الرغامى. بعد 10 دقائق من الحقن luciferin ، تم الحصول على الصور التلألؤ لمدة 10 دقيقة على 4 وظائف : ، البطنية الظهرية ، الجانب الأيسر والجانب الأيمن.

الشكل 2. شدة الضوء كمية من الفئران المصابة ببكتيريا معربا عن CBRluc (A ، B) الصور التلألؤ تحليل عائد الاستثمار وتدفق كمية الضوء من مجموع عائدات الاستثمار في المناصب ظهري وبطني ، على التوالي. الفئران غير المصابة الموجودة على اليسار واثنين من الفئران المصابة هي على حق. تم الحصول على الصور من التلألؤ س الرئتينو الفئران غير المصابة والمصابين CBRlux (ن = 2). وكان كميا لشدة الضوء حول الرئتين عن طريق تحليل العائد على الاستثمار. C) صور فيفو السابقين في الرئتين من الفئران (أسفل مجموعتين من الرئتين) غير مصاب (أعلى) والمصابة. تم حقن Luciferin 5 miniuts قبل القتل الرحيم والصور تم الحصول عليها بعد ذلك. تم تطبيع القيم كميا لCFU.

الشكل 3. تعمير 3D مصدر تلألؤ بيولوجي (ق) من الفأر المصاب الرئوي. كانت مصابة والفأر مع البكتيريا CBRluc معربا عن طريق الحقن داخل الرغامى. وقد حصلت على تسلسل الصور باستخدام مرشحات مختلفة من انبعاث موجات من 540 نانومتر المسلسل إلى 700 نانومتر. وكان يستخدم لإعادة تسلسل الصور 3D لمصدر التألق في المواضيع التي تحتوي على الحيوانات ايماج منظم. أ) يظهر التصوير المقطعي للماوس في مواقف مختلفة : في الأمام والخلف واليمين واليسار. وترد مصادر الضوء وvoxels (مربعات حمراء داخل الماوس 3D) التي تقع داخل الرئة وفقا لما يحدده إعادة الإعمار. ب) خريطة densiy فوتون البيانات المقاسة والمحاكاة. مقارنة بين كثافة الفوتون قياس ومحاكاة منحنيات توفير المعلومات لنوعية البناء. نتيجة جيدة النوعية في إعادة بناء كثافة مماثلة قياس الفوتون والمحاكاة.

Discussion

على الرغم من أن هذه البروتوكولات التالية سوف يؤدي عادة في صور ذات جودة عالية ، فإنه من المهم للنظر في بعض القضايا الرئيسية من أجل الحصول على بيانات دقيقة ومتناسقة من الدراسات التصوير. وينبغي الحصول على الصور التي تهم التلألؤ من 600 إلى 60000 لضمان أن تكون الإشارة أعلاه ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
Ketamine	Butler Animal Health Supply
Xylazine	MP Biomedicals	158307
Luciferin	GMT	LUCK-100
Fetal plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
Cathether (22G x 1”)	Terumo Medical Corp.	OX2225CA
Guide wire	Hallowell EMC	210A3491
Octocope with speculum	Hallowell EMC	000A3748
Xenogen IVIS system	Caliper Life Sciences
XGI-8-gas Anesthsia System	Caliper Life Sciences
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences
Transparent nose cones	Caliper Life Sciences
Light baffle divider	Caliper Life Sciences