שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Summary

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

Abstract

הדמיה היא טכניקה ערך שיכולים לשמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים. בפרט, נוכחות של תאים סרטניים, בתאי גזע, סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, פתוגנים נגיפיים, טפילים וחיידקים ניתן בעקבות בזמן אמת תוך חיים בעלי חיים ^1-2. יישום של הדמיה פליטת אור ללימוד פתוגנים יש יתרונות לעומת אסטרטגיות לניתוח קונבנציונלי של זיהומים במודלים של בעלי חיים ^3-4. זיהומים ניתן דמיינו בתוך חיות אדם לאורך זמן, ללא צורך המתת חסד כדי לקבוע את המיקום והכמות של הפתוגן. הדמיה אופטית המאפשרת בחינה מקיפה של כל רקמות ואיברים, ולא דגימה של אתרים ידועים בעבר להיות נגועים. בנוסף, הדיוק של חיסון לתוך רקמות ספציפיות ניתן לקבוע ישירות לפני ביצוע חיות קדימה שהיו מחוסן הצלחה לאורך הניסוי כולו. השוני בין בעלי החיים יכול להיות נשלט, מאחר הדמיה מאפשר לכל בעל חיים אחר להיות בנפרד. הדמיה יש פוטנציאל לצמצם במידה ניכרת את מספר בעלי החיים הדרושים בגלל היכולת לקבל נתונים מנקודות זמן רב מבלי מדגם רקמות כדי לקבוע ^3-4 לטעון הפתוגן.

פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמיין זיהומים בבעלי חיים באמצעות דימות של פליטת אור רקומביננטי זנים של חיידקים להביע בלוציפראז. החיפושית לחץ (CBRLuc) ו luciferases גחלילית (FFluc) לנצל luciferin כמו מצע ^5-6. האור המיוצר על ידי שתי CBRluc ו FFluc יש אורך גל רחב של nm 500-700 ננומטר, מה שהופך את אלה luciferases כתבים מעולה עבור דימות אופטי במודלים של בעלי חיים החיים ^7-9. זה בעיקר בגלל אורכי הגל של האור יותר מאשר 600 ננומטר נדרשים כדי למנוע ספיגה של המוגלובין, ולכן עוברים דרך רקמות יונקים ביעילות. בלוציפראז הוא הציג גנטית לתוך חיידקים כדי לייצר אות אור ^10. עכברים הם ריאתי מחוסן עם חיידקים bioluminescent intratracheally לאפשר ניטור של זיהומים בזמן אמת. לאחר הזרקת luciferin, תמונות נרכשים באמצעות מערכת דימות IVIS. במהלך הדמיה, עכברים מורדמים עם isoflurane באמצעות XGI-8 מערכת Anethesia גז. דמויות יכולות להיות מנותח למקם ולכמת את מקור האות, המייצגת את אתר זיהום חיידקי (ים) ומספר, בהתאמה. לאחר הדמיה, נחישות CFU מתבצעת על רקמת הומוגני כדי לאשר את קיומו של החיידק. כמה מנות של חיידקים המשמשים לקשר בין מספרי חיידקים עם הארה. הדמיה ניתן ליישם מחקר של הפתוגנזה והערכה של יעילות של תרכובות וחיסונים אנטיבקטריאלי.

Protocol

1. זיהום ריאתי ידי אינטובציה Intratracheal

1. לשקול עכברים, אופציונלי, סימני יכול להתבצע על האוזניים לזיהוי קל.
2. להרדים את העכברים עם קטמין (100 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) ו xylazine (10 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) על ידי חיסון intraperitoneal.
3. המקום עכברים בכלובים עד בהרדמה מלאה. לסחוט את כריות רגליהם כדי לבדוק דוושת רפלקס. עכברים צריך להציג מופחת או ללא תגובת רפלקס.
4. מניחים את העכבר על דוכן אינטובציה שוכב על גבו.
5. תקן גומייה לעמוד אינטובציה, ואז למקם אותו תחת החותכות העליונות של העכבר. השתמש קלטת לתקן ידיים ורגליים על דוכן אינטובציה.
6. בעדינות להזיז tougue מהפה באמצעות מלקחיים.
7. הכנס ספקולום עם octoscope בתוך הפה ולהסתכל לתוך oropharynx עד לפתיחת הגרון גלוי.
8. מדריך מתקדם תיל מכוסה cathether לתוך קנה הנשימה עד catether הרכזת נמצאת החותכות. הסר חוט מדריך. מכניסים אוויר לתוך cathether לצפות התרחבות החזה לאשר אינטובציה הנכון.
9. הזרק 50 μL של חיידקים (ב מהתמונות המוצגות השתמשנו חיידק Calmette גרן (BCG) מביע לחץ חיפושית אדומה בלוציפראז (CBRLuc), שנבנה במעבדה שלנו, אלא כל זן חיידקי זורח יכול לשמש) פתרון באמצעות cathether באמצעות מזרק 1 מ"ל.
10. המקום עכבר בכלוב ולצפות בו במהלך ההתאוששות מן ההרדמה.

2. בעלי חיים הרדמה והכנה הדמיה פליטת אור

עכברים עם isoflurane מורדמים באמצעות XGI-8 מערכת Aneshesia גז.

1. לפני מערכת ההפעלה-8 XGI הרדמה, לשקול כל מיכל פילטר פחם ולכתוב את המשקל תאריך. אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי, להחליף אותו עם בלון חדש.
2. בדוק את מפלס isoflurane ב מאדה ולמלא אותו במידת הצורך.
3. הפעל את המשאבה פינוי בחלק הקדמי של מערכת XGI 8-הרדמה מוגדר LPM 8 (ליטר minuite).
4. הפעל את אספקת החמצן מן הצילינדר בלחץ גבוה ולהגדיר אותו psig 55.
5. הפעל את החמצן לעבור (ירוק) על החלק הקדמי של מערכת XGI-8 הרדמה.
6. הפעל את זרימת הגז לחדר ההדמיה כדי לקבוע את רמת זרימת הגז. הגדר LPM 0.25 ואז לכבות את זרימת הגז.
7. הפעל את זרימת הגז לתא אינדוקציה הרדמה כדי להגדיר את רמת זרימת הגז. הגדר LPM 1.5 ולאחר מכן כבה זרימת הגז.
8. הפעל את isoflurane עם מאדה ולהגדיר ל 2-2.5. רמת isoflurane יכול להיות מותאם בהתאם למספר בעלי חיים בשימוש במשקל.
9. המקום עכברים לתוך תא אינדוקציה ולסגור את המכסה. הפעל את זרימת הגז לתא אינדוקציה. עכברים מקום בחדר עבור 5-10 minuites עד שהם להרדים לגמרי.
10. החל משחה אופטי לעיניים כדי להגן על העיניים עכבר במהלך הדמיה המקום עכברים בחדר הדמיה באחד הקונוסים האף על סעפת ההרדמה. השתמש לבלבל בין אור עכברים כדי למנוע השתקפות של אור על נושאים בעלי חיים הסמוכה.
11. הזרק luciferin (150 מיקרוגרם / גרם של משקל הגוף) על ידי חיסון intraperitoneal.

3. פליטת אור הדמיה

1. הפעל את התוכנה הדמיה חיים.
2. אם המערכת לא מאותחל, לאתחל את מערכת הדמיה IVIS.
3. הגדר את הפרמטרים עבור הדמיה על ידי לחיצה על הגדרת רצף בלוח הבקרה IVIS הרכישה.
   בחר הארה ולצלם במצב הדמיה. אם האפשרות לבצע DLIT 3D השיקום הוא הרצוי, בחר תמונות צילומי אור, זורח מבניים כחלק רצף התמונה.
   הגדרת זמן חשיפה של שניה 0.5-10 דקות.
   הגדר binning ו-F / להפסיק מבוסס על בהירות הצפוי של המדגם.
   הגדר עירור במסנן כדי לחסום פליטת לסנן לפתוח, אלא אם כן מתכננים לרכוש רק אורכי גל מסוימים של אור. במקרה של DLIT 3D חוקה, להגדיר מסנני פליטה כפולה של אורכי גל שונים על מנת לאפשר איתור מדויק של המקור.
   הגדר FOV מ-A עד D תלוי במספר של עכברים או באזור של חיה להיות צילמו. בחר A ו-B עבור עכבר 1, C עבור עכברים 2-3, 4-5 ו-D עבור עכברים.
4. לחץ להוסיף באשף תמונה בלוח רכישת שליטה כדי להוסיף את ההגדרה ברצף.
5. התחל רצף הדמיה ידי לחיצה לרכוש.
   במקרה של בנייה 3D DLIT, תמונות זורח יירכשו עבור מסנני פליטה מרובה באורכי גל שונים. תמונות אור צילום מובנים יהיה גם רכש.
6. במהלך הרכישה את התמונה ולערוך רמות לוחות תמונה יהיה גלוי. מלא כמו מידע מפורט ככל האפשר עבור כל ניסוי ב לערוך תמונה כדי להבטיח מעקב קל של תמונות בכל עת לאחר מכן לשמור את התמונות.
7. ReRemove העכברים מן IVIS הדמיה קאמרית ולהחזיר אותם בכלובים שלהם. שימו לב ההתאוששות מןesthesia כדי להבטיח עכברים לא הושפעו באופן משמעותי על ידי ההליך. בעלי חיים צריכים להיות תחת פיקוח מתמיד עד שהם להחלים לחלוטין מן ההרדמה (בדרך כלל 1-2 דקות).

4. Ex vivo הדמיה וניתוח CFU עבור כימות של חיידקים בריאות

1. הזרק עכברים עם luciferin intraperitoneally באופן זהה עבור הדמיה, זמן קצר לפני המתת חסד.
2. להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal של 100 דקות מ"ג / ק"ג 5 pentobarbitol לאחר ההזרקה luciferin.
3. Explant הריאות של עכברים מקום סטרילי, צלחות פטרי סטרילי באמצעות מלקחיים ומספריים.
4. מניחים צלחת פטרי, המכיל איבר explanted בתחום ההדמיה קאמרית לרכוש תמונות פליטת אור באותו אופן כמו כל עכבר.
5. לאחר הדמיה, להסיר איבר explanted מתוך צלחת פטרי באמצעות מלקחיים סטרילית homogenize ב 1 מ"ל PBS.
6. הפוך את דילולים ורקמות הצלחת על התקשורת סלקטיבית המתאימה. רקמה הומוגני יכול להיות מאוחסן -80 מעלות ציפוי מחדש זה צריך להיות הכרחי. לחלופין, רקמה הומוגני יכול לשמש להפקת RNA או DNA לכמת במספרים חיידקי ידי qPCR.

5. ניתוח הדמיה הארה

1. התחל "Imaging Software חי" ולגלוש קבצי תמונה.
2. השתמש "Palette Tool" כדי להתאים את התמונות. לחץ על התמונה כדי לשנות את כוון תיקון / סינון הגדרות מינ '/ מקס עבור קשקשים צבע בודדים.
3. השתמש בכלים ROI ברשימה הנפתח עבור כימות של עוצמת אור. צורת בחר ROI, מספר וגודל. גרור ROI מסגרת לאזור הריבית על התמונה. ודאו כי כל ROI הם באותו גודל וצורה. לחץ ROI מדידה לשמור, להעתיק ו / או לייצא נתונים כמותיים.
4. במקרה של 3D שחזורים DLIT, עומס התמונה ברצף, כולל התמונה אור מובנה. לחץ על הטופוגרפיה משטח בכלי פלאט. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה מחדש כדי ליצור את הטופוגרפיה משטח. בלגן משטח יופיע בחלון.
5. בחר שחזור DLIT 3D של כלי פלאט. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה מאפיינים כדי להגדיר מאפיינים רקמות ספקטרום המקור. שרירים מומלץ ברוב הנסיבות. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה ניתוח כדי לבחור את אורך הגל לניתוח. לחץ על הכרטיסייה פרמטרים ואשר ערכי ברירת המחדל או לשנות פרמטרים DLIT במידת הצורך. לחץ על הכרטיסייה כדי להתחיל לשחזר ניתוח 3D.
6. כאשר שחזור 3D נגמר, תצוגת 3D יציג את התוצאות של שיקום 3D. לחץ על הכרטיסייה כדי לראות את תוצאות ניתוח נתונים על צפיפות, voxels פוטון ופרמטרים אלגוריתם DLIT.
7. שמירה ו / או לייצא את התוצאות של ניתוחי שחזור 3D לדמויות וקבצי נתונים.

6. נציג תוצאות:

התמונות של פליטת אור עכברים נגועים בחיידקים bioluminescent יחד עם שליטה בעכבר נגוע מוצגים באיור 1. ריאתי עכברים נגועים בחיידקים bioluminescent לייצר אות משמעותי מן הריאות (איור 1). עוצמת הארה היא לכמת כמו בתוך השטף סך ההחזר על ההשקעה (האזור של עניין) (איור 2). נתונים כמותיים על עוצמת האור הוא מנורמל עבור יחידות המושבה להרכיב (CFU) של חיידקים המתקבל הריאות כדי לאשר את האות מופק החיידקים bioluminescent וניתן לעומת שליטה שלילית. מיקום ועוצמת האות ניתן לנתח עוד יותר על ידי שחזור 3D DLIT מקור הארה מבוסס על טומוגרפיה של משטח העכבר ^11. ניתוחים אלו מאפשרים כימות ולוקליזציה של האות bioluminescent מיוצר. התוצאות של שיקום 3D של מקור זורח בעכברים נגועים מוכיח כי אור מופק הריאות של העכבר (איור 3). התמונות vivo לשעבר של הריאות וכתוצאה מכך עכבר הארה לאשר כי נפלט מהריאות, ולא רקמות איבר כלשהו juxtaposed מקרוב אחר או (איור 2C).

באיור 1. הדמיה הארה של עכברים נגועים ריאתי עם חיידקים bioluminescent מתוייגים עם CBRluc. העכבר לשלוט נגוע נמצא משמאל ושני עכברים נגועים נמצאים בצד ימין. עכברים שהיו נגועים בחיידקים להביע CBRluc (n = 2) בציר intratracheal. 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, תמונות הארה נרכשו עבור 10 דקות ב 4 עמדות: הגב, בצד הגחוני, שמאל ימין.

איור 2. עוצמת האור כמותי של עכברים נגועים בחיידקים להביע CBRluc. (A, B) תמונות הארה של ניתוח ROI ואת השטף הכולל לכמת אור מן ההחזר על ההשקעה במיקומים הגבי ו הגחון, בהתאמה. עכברים נגוע הם בצד שמאל ושני עכברים נגועים נמצאים בצד ימין. תמונות הארה נרכשו מהריאות of עכברים נגועים נגוע ו CBRlux (n = 2). עוצמת האור סביב הריאות היה לכמת ידי ניתוח ROI. ג) תמונות לשעבר vivo של הריאות מן (למטה שתי קבוצות של הריאות) עכברים נגוע (למעלה) ו נגועים. Luciferin הוזרק לפני 5 miniuts של המתת חסד ותמונות נרכשו לאחר מכן. הערכים לכמת הם מנורמל ל CFU.

איור 3. שחזור 3D של מקור פליטת אור (ים) עכבר נגוע ריאתי. העכבר היה נגוע בחיידקים להביע CBRluc בזריקה intratracheal. רצף התמונה נרכשה באמצעות מסנני פליטה שונות של אורכי גל סדרתי של nm 540-700 ננומטר. רצף התמונה שימש הכינון מחדש 3D עבור מקור הארה בנושאים בעלי חיים ובו מתאר לעצמי מובנים. א) טומוגרפיה על העכבר מוצגת במיקומים שונים: מלפנים, מאחור, על ימין ועל שמאל. מקורות אור מוצגים voxels (תיבות אדום בתוך העכבר 3D) הממוקמים בתוך ריאה כפי שנקבע על ידי שחזור. ב) פוטון densiy המפה של הנתונים שנמדדו מדומה. השוואת צפיפות עקומות נמדד מדומה פוטון לספק את המידע באיכות השיקום. איכות שחזורים טובים התוצאה דומה לצפיפות פוטון נמדד מדומה.

Discussion

למרות הבאים הפרוטוקולים הללו יהיו בדרך כלל תוצאה של תמונות באיכות גבוהה, חשוב לשקול כמה נושאים מרכזיים על מנת לקבל נתונים מדויקים ועקביים של לימודי הדמיה. תמונות הארה יש רכשה כי יש ספירת 600 מתוך 60,000 כדי להבטיח כי האות מעל הרקע ואת המצלמה לא רווי. אם האות המתקבל הוא פחו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	VETONE	501027
Ketamine	Butler Animal Health Supply
Xylazine	MP Biomedicals	158307
Luciferin	GMT	LUCK-100
Fetal plus solution	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
Cathether (22G x 1”)	Terumo Medical Corp.	OX2225CA
Guide wire	Hallowell EMC	210A3491
Octocope with speculum	Hallowell EMC	000A3748
Xenogen IVIS system	Caliper Life Sciences
XGI-8-gas Anesthsia System	Caliper Life Sciences
Living Imaging Software	Caliper Life Sciences
Transparent nose cones	Caliper Life Sciences
Light baffle divider	Caliper Life Sciences