تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

Summary

مظاهرة رسمية للتشريح العين الماوس ، مما أدى إلى تحميل كامل من الظهارة الصبغية الشبكية.

Abstract

الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) وتقع في الجزء الخلفي من العين الثدييات ، فقط تحت الشبكية العصبية ، والتي تحتوي على المستقبلات الضوئية (قضبان ومخاريط). وRPE هو أحادي الطبقة من الخلايا الصباغية مكعبية وبشكل وثيق مع شركاء العصبية في الشبكية فقط فوقه. هذا الارتباط يجعل من RPE اهتماما كبيرا للباحثين الذين يدرسون أمراض الشبكية. وRPE هو أيضا موقع لفحص في الجسم الحي من التماثل الموجه إصلاح الحمض النووي ، ومقايسة ^{للأمم المتحدة} ع. العين الماوس صعبة للغاية لتشريح بسبب حجمها الصغير (حوالي 3.5mm في القطر) وشكلها كروي. هذه المقالة يوضح بالتفصيل عن إجراء تشريح للعين مما يؤدي إلى تحميل كامل RPE. في هذا الإجراء ، وتبين لنا كيفية العمل معها ، وليس ضد ، والهيكل الكروي للعين. باختصار ، تتم إزالة النسيج الضام والعضلات ، والعصب البصري من الجزء الخلفي من العين. ثم ، يتم إزالة القرنية والعدسة. المقبل ، يتم إجراء تخفيضات الاستراتيجية التي تؤدي إلى تسطيح كبير من الأنسجة المتبقية. أخيرا ، رفع بلطف العصبية في الشبكية الخروج ، كشفت عن RPE سليمة ، والتي لا تزال تعلق على المشيمية الكامنة والصلبة. ويمكن استخدام هذا كله جبل لتنفيذ مقايسة ^{للامم المتحدة} لتقييم p أو المناعية أو مناعي من النسيج RPE.

Protocol

1. إزالة أنسجة غريبة من خارج العين

1. صب 1X PBS في غطاء من صحن 35mm. وينبغي أن تكون على مستوى أقل بقليل من شفة الغطاء.
2. باستخدام الملقط على التوالي ، ونقل العين (ق) من الأنبوب التخزين إلى صحن 35mm. وغرقت العيون في برنامج تلفزيوني لسببين : 1. فإن أنسجة غريبة "تعويم" بعيدا عن العين بحيث يمكنك رؤية وإزالتها بسهولة ، و 2. أثناء تشريح ، فإن الحفاظ على العين بشكل طبيعي شكله الكروي بينما في التعليق ، مما يسمح لك العمل مع هذا الشكل وليس ضدها.
3. باستخدام كل من أزواج من ملقط الزاوية (45 درجة و 15 درجة) ، وإزالة الكثير بلطف والعضلات والنسيج الضام وقت ممكن ، وسحب النسيج ضد التيار (أي نحو القرنية). سوف تبقى بعض النسيج الضام. وينبغي بذل الجهود للضغط مقلة العين أقل قدر ممكن.
4. تجارتك 15 ° للملقط مقص الربيع. في حين عقد ثابت مع العين ملقط 45 درجة ، واستخدام المقص لقطع الربيع بعيدا المتبقية العضلات والنسيج الضام ، وكذلك على العصب البصري. * نصيحة : استخدم حافة خارج مقص لدفع الأنسجة ضد الحبوب (نحو الفجوة corneo - الصلبة) ثم تقليم. تستمر حتى تمت إزالة جميع أنسجة غريبة من العين.

2. إزالة القرنية والعدسة

1. مع القرنية مواجهة ، استخدم ملقط 45 درجة تصل إلى أضعاف قرصة صغيرة في وسط القرنية.
2. باستخدام مقص الربيع ، وجعل شق صغير في قاعدة رفرف. ترك من دحرج.
3. عقد وجهة نظر لا يزال بالملقط الخاص ، تضاف إلى أقل شفرة المقص وعمودي على شق واجراء خفض في اتجاه تقسيم corneo - الصلبة. محاولة للحفاظ على النصل السفلي الخاص تحت القزحية حتى يتم قطع كل من القرنية والقزحية. لا قطع كل الطريق إلى تقسيم corneo - الصلبة. إبقاء مقص إدراجها في العين.
4. باستخدام الملقط الخاص 45 درجة ، وتناوب على العين بعناية بحيث المقص الخاص موازية لتقسيم corneo الصلبة ، وجعل قطع صغيرة. استدارة 360 درجة ببطء العين ، مما يجعل من شقوق صغيرة على طول الطريق حول. مرة أخرى ، في محاولة للحفاظ على شفرة أقل من مقص الربيع الخاص تحت القزحية حتى يتم قطع كل من القزحية والقرنية. رفع القزحية والقرنية بعيدا عن بقية العين والتخلص منها.
5. إمالة العين على جانبها والضغط برفق في النصف الخلفي من العين ، مما اضطر الى العدسة. تجاهل العدسة. غير مبطنة من الداخل فنجان العين المتبقية العصبية في الشبكية ، والتي ينبغي أن ننظر على نحو سلس وشفاف.

3. ربع فنجان العين الناتجة عن ذلك ، مما أدى إلى 4 -- "petaled" ، مثل هيكل الزهور

1. وينبغي وضع هذه العين التي افتتاح فنجان العين هو عمودي على جسمك. استخدام الملقط الخاص إلى 45 درجة في فنجان العين ثابت والموقف.
2. عقد مقص الربيع الخاص أمامك بحيث تكون عمودية على الجسم ، وإدراج شفرة أقل من مقص الربيع الخاصة بك في الحافة العليا من كأس العين مفتوحة. باستخدام الملقط الخاص ° 45 ، محاذاة بعناية كوب العين بحيث يمكن إجراء واحد ، قطع على التوالي من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري. وينبغي أن تكون جميع قطع عمودي على تقسيم corneo الصلبة ، وإلا المحدد ، يجب أن تذهب إلى أقرب رئيس العصب البصري ممكن دون أن يقطع فيه.
3. تدوير فنجان العين 180 درجة ، والحفاظ على تعامد مع جسمك. استخدام التقنية في خطوة 3.2 إلى اجراء خفض عمودي الثانية.
4. تدوير فنجان العين وكرر وصف هذه التقنية في جعل 3.2 إلى اثنين آخرين من التخفيضات. ينبغي لجميع التخفيضات الأربعة قد أقرب إلى 90 درجة بعيدا ممكن. نضع في اعتبارنا أن العين ليست كروية تماما لذلك سيكون هناك بعض التباين.

4. قطع كل من "بتلات" الأربع في النصف ، مما أسفر عن بنية تشبه زهرة ثمانية البتلة.

1. نقل فنجان العين إيواء من الطبق 35mm إلى شريحة نظيفة. مع فنجان العين مواجهة ، مغرفة تحته مع ملقط 45 درجة. رفع بعناية للخروج من السائل ووضعها على شريحة نظيفة.
2. باستخدام كل من أزواج من ملقط الزاوية ، افتح برفق خارج العين ، وشبكية العين مع مواجهة العصبية. لا تقم بإزالة الشبكية العصبي ، فهو يساعد في الحفاظ على العين بعض من شكله الكروي حتى انك لا يعمل ضدها. لأنه يحمي أيضا من التلف RPE بالصدفه في الإجراءات التالية.
3. تدوير الشريحة حتى واحدة من بتلات هو عمودي على جسمك.
4. استخدام الملقط الخاص ° 15 ، والاستيلاء على بلطف زاوية البتلة. ينبغي زاوية البتلة تكون القرنية ، وليس الشبكية أو العصبية RPE. ترفع في الزاوية بلطف ، والسماح لها بالاحتفاظ بها انحناء.
5. إدراج شفرة أسفل المقص الخاص الربيع بين البتلة وحرك. يصطف المقص الخاص بحيث يمكن إجراء ، مستقيم واحد ، وقطع عمودي من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري. قطع أقرب إلى رأس العصب البصري ممكن دون أن يقطع فيه. أتركوبتلة ، والسماح لها على الاستلقاء على الشريحة.
6. تدوير شريحة 90 درجة ، بحيث البتلة المقبل هو عمودي على جسمك. كرر الخطوة 4.5.
7. كرر الخطوات من 4.5 و 4.6 ضعف أكثر. ينبغي أن يكون هيكل الناتج تبدو وكأنها زهرة ثمانية البتلة.

5. إزالة العصبية في الشبكية

1. ماصة 100-200 ميكرولتر من 1X PBS على العينة. وهذا سيمنع الشبكية العصبية من الالتصاق كما كنت قشر تشغيله من RPE.
2. عادة ما يتم إرفاق فضفاضة العصبية في الشبكية إلى RPE. ومع ذلك ، فإنه لا يأخذ الممارسة ، والمهارة الوحيدة لإزالة العصبية في الشبكية وليس RPE. فهم بلطف بتلة من العصبية في الشبكية مع زوج واحد من ملقط الزاوية حين استقرار (باستمرار) بقية العين مع الزوج الآخر من الزاوية ملقط. سحب العصبية في الشبكية بعيدا عن بقية العين. يستمر هذا الإجراء حتى تم إزالة كامل الشبكية العصبية. * تلميح : عصا غيض من الملقط 15 ° الخاص في رأس العصب البصري إلى مرساة العين. ثم استخدم ملقط 45 درجة على كنس الشوارع تحت الشبكية العصبية ورفع وتشغيله بعيدا. فمن الأفضل عادة لرفع الشبكية العصبية من رأس العصب البصري نحو الفجوة corneo - الصلبة. يجب التأكد من الانسحاب من أي مخلفات فضفاض من القزحية. القزحية هي لزجة جدا ويمكن أن تتعثر وإلا لRPE.
3. شطف العينة مع 1X PBS. ماصة 100-200 ميكرولتر من 1X PBS في العينة وتمتص منه مرة أخرى. تجاهل برنامج تلفزيوني. كرر حسب الضرورة لإزالة الغبار والحطام.

6. جبل لك عينة (ق) على شريحة

1. ماصة 80-90 ميكرولتر من الجلسرين 90 ٪ على شريحة جديدة في شكل مستطيل. استخدام الجانب من طرف ماصة لجعل حتى مسحة مستطيلة من الجلسرين. (هذا هو الإجراء لتركيب two RPE على شريحة واحدة).
2. إدراج أقل من 15 ذراع ملقط ° تحت العينة. رفع بلطف العينة خارج الشريحة تشريح.
3. انخفاض ببطء العينة إلى الجلسرين. تذبذب بلطف ملقط كما كنت اخراجهم من تحت العينة.
4. كرر الخطوات من 6،1-6،3 لعينة أخرى.
5. تدوير الشرائح بحيث الجانب الطويل هو عمودي على جسمك. عقد الزجاج الخاص تغطية على زاوية 45 درجة إلى الشريحة بحيث أنه لمس الشريحة. تحريكه باتجاه تشويه الجلسرين حتى اللمس. الحفاظ على الاتصال بين الزجاج وتغطي الشريحة ، تتحرك ببطء زجاج الغطاء بعيدا عن التشويه ، باتجاه حافة الشريحة. يصطف الجانبين طويلة من الشريحة وزجاج الغطاء بحيث تكون متوازية. عقد أركان الزجاج غطاء بين الإبهام والسبابة.
6. التقاط ملقط ° 15 في يدك الأخرى. مهد العليا (مجانا) حافة الزجاج في تغطية المحتال من ذراعه. ببطء شديد ، وانخفاض الغطاء الزجاجي. عندما يتم الاتصال بين زجاج الغطاء والجلسرين ، والتوقف والانتظار لالجلسرين للهجرة. كرر هذا خفض والانتظار حتى يتم تغطية كاملة يتصاعد RPE كله. هذا هو لمنع الجلسرين عالية اللزوجة من التقاط فقاعات الهواء. لا تضغط باستمرار على ساترة -- الجلسرين والضغط من تحت ، مما يجعل الالتصاق سيئة للغاية.
7. مع طلاء الأظافر واضحة ، والطلاء حول محيط حيث يغطي الزجاج وتلبية الشريحة.
8. مكان الشريحة على قمة الرف فارغة لتجف.

7. ممثل النتائج :

وينبغي أن تكون نتيجة هذا الإجراء أن يكون الهيكل الذي يشبه الزهرة ، وينبغي أن تكون متماثلة إلى حد ما.

الشكل 1. وينبغي تحميل كامل من RPE ماوس C67Bl/6J wildtype. RPE من الأسود أو الحيوانات آغوطي تكون مظلمة في اللون البني ويجب أن يكون السطح على نحو سلس. فمن الطبيعي أن نلاحظ التموجات في الطوبوغرافيا من بتلات. قد تصبغ على أية عينة إعطاء تكون متغيرة بعض الشيء ، نظرا لكثافة المتغير تصبغ RPE على حد سواء والمشيمية الكامنة. الأسهم البيضاء تشير الى "قنوات" ناقصة الصباغ -- وهذا أمر طبيعي ويعود إلى الأوعية الدموية الكامنة وراء العين. السهم الأزرق يشير إلى أن الأضرار المادية على حد سواء RPE والمشيمية الكامنة.

الشكل 2. كله من جبل RPE ماوس المخففة. العينات يمكن حصادها من الحيوانات تتراوح في تخفيف لون شفاف تقريبا من الاتحاد الافريقي مقهى قهوة بحليب وأية عينة واحد هو أن يكون التباين في داخله ، وأشار في الدوائر السوداء هنا. بصفة عامة ، RPE تحصد من الحيوانات الأصغر سنا هي أخف وتلك التي تحصد من أقدم الحيوانات أغمق. السهام السوداء تشير بعض الأوعية الدموية الكامنة ، والتي تظهر ناقصة الصباغ.

الشكل 3. يمكن استخدامها للكشف عن تلطيخ Phalloidin أضرارا مادية RPE. Phalloidin تلطيخ يحدد بوضوح الخليةالأغشية ، وتظهر على شكل سداسي من الظهارة. (أ) مثال من الماوس السوداء. (ب) مثال من الماوس المخففة.

الشكل 4. A RPE تشريح سيئة من تمييع ماوس (أ) بين قوسين تشير إلى أن هامش القرنية واسعة جدا ، والذي يمكن أن يسبب التواء و / أو قابلة للطي. داخل دائرة سوداء يمكنك رؤية كميات كبيرة من الأنسجة الغريبة التي لم يتم إزالتها من الجزء الخلفي من العين. فهي واضحة ولا سيما لأن العينة من حيوان المخففة. غير مطوية جزئيا بتلة على اليسار أسفل أكثر. (ب) وهذا كله قد يشن مظهر الدولاب على الهواء. السهام السوداء تشير بعض التخفيضات التي تم إجراؤها. العديد من التخفيضات من الفجوة corneo - الصلبة تجاه رأس العصب البصري لا يتماشى مع القطر. (C) السهام السوداء تبين كيف كان ينبغي أن التخفيضات التي أجريت ، وذلك تمشيا مع قطر وعمودي على المماس.

Discussion

وRPE هو موقع ^{للامم المتحدة} مقايسة ع ، وهي مقايسة في الجسم الحي للإصلاح ، تناظر الموجهة. وقد استخدمت ^{الأمم المتحدة} للمقايسة p لدراسة آثار أضرار الحمض النووي DNA ومختلف ^1،2 يشير الضرر وإصلاح الجينات ^3،4،5 على وتيرة الإصلاح ، ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
straight forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4903	tip: .08 x .04 mm material: INOX
45° forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	tip: .05 x.01 mm material: INOX
15° "up" forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045A	tip: .1 x.06 mm material: INOX
spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5604	comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel
binocular dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	Discovery V.8	use reflected light source
phalloidin	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546