Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

Özet

Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.

Özet

Memeli gözün arkasındaki retina pigment epitel (RPE), fotoreseptör (çubuklar ve koniler) içeren nöral retina altında yatıyor. RPE yakından sadece yukarıda nöral retina ile pigmentli küboid hücreleri ve iştiraklerin tek tabaka. Bu dernek, retina hastalıklarının çalışan araştırmacılar büyük ilgi RPE yapar. RPE homoloji yönettiği DNA onarımı, p ^un tahlil in vivo tayininde bir sitedir. Küçük boyutu nedeniyle teşrih (çapı 3.5mm hakkında) ve küresel şekli fare göz özellikle zordur. Bu makalede ayrıntılı olarak RPE bir bütün montaj ile sonuçlanan göz diseksiyon için bir prosedür ortaya koymaktadır. Bu prosedürde, küresel yapısı, karşı göz ile değil, nasıl çalıştığını gösteriyor. Kısaca, bağ dokusu, kas, ve optik sinir gözün arka kaldırılır. Sonra, kornea ve lens kaldırılır. Sonraki kalan doku önemli düzleşme, stratejik kesimler bu sonucu yapılır. Son olarak, nöral retina nazikçe, hala altta yatan koroid ve sklera bağlı bozulmamış bir RPE, ifşa, kapalı olduğunu kaldırdı. Bütün bu montaj p ^un tahlil veya RPE doku immünhistokimya veya immunofluorescent değerlendirilmesi için gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Protokol

1. Gözün dışında fazladan doku çıkarın

1. 1X PBS 35mm çanak kapağı içine dökün. Seviyesi sadece kapağın dudak altında olmalıdır.
2. 35mm çanak depolama tüpü düz forseps, transfer göz (ler) kullanarak. 1: Gözler iki nedenden ötürü PBS batmış. Görmek ve onları kolayca kaldırmak ve 2, böylece gereksiz dokular göz "float". Diseksiyon sırasında asılı kalırken, gözün doğal olarak buna karşı ziyade bu şekli ile çalışmak için izin, küre şeklini koruyacaktır.
3. Açılı forseps (45 ° ve 15 °) her iki çifti kullanarak, hafifçe (kornea doğru yani) tahıl karşı doku çekerek, mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu gibi çıkarın. Bazı bağ dokusu kalacaktır. Çaba mümkün olduğunca az göz küresinin sıkmak için yapılmalıdır.
4. Yaylı makas için 15 ° forseps Tic. 45 ° forseps ile göz sabit tutarken, kalan kas ve bağ dokusunun yanı sıra optik sinir kesip yaylı makas kullanın. * İpucu: Döşeme sonra tahıl karşı doku itmek için makas dış kenarına kullanın (corneo skleral bölmek doğru). Tüm yabancı doku, göz çıkarıldı kadar devam edin.

2. Kornea ve lens çıkarın

1. Kornea yukarı bakacak şekilde, kornea merkezinde kat küçük bir çimdik 45 ° forseps kullanabilir.
2. Yaylı makas kullanılarak, flep tabanında küçük bir kesi yapmak. Flep gidelim.
3. Holding gözleri hala forseps düşük makas bıçak yerleştirin ve kesi dik ve corneo skleral bölmek doğru bir kesim yapmak. Alt bıçak, hem kornea ve iris kesilir, böylece, iris altında tutmak için çalışın. Corneo-skleral bölmek için tüm yol kesmeyin. Göz takılı makas tutun.
4. 45 ° forseps kullanarak, dikkatli bir makas corneo-skleral bölmek için paralel böylece göz döndürmek ve küçük bir kesim yapmak. Yavaş yavaş, etrafında küçük kesiler tüm yol, göz 360 ° döndürün. Yine, yaylı makas alt bıçak, iris ve kornea kesilir, böylece, iris altında tutmaya çalışın. Iris ve kornea gözün geri kalanı uzakta kaldırın ve atın.
5. Göz yan yatırın ve lens zorlayarak, gözün arka yarısında hafifçe bastırın. Lens atın. Kalan Göz yuvası içinde nöral retina, pürüzsüz ve mat görünmelidir kaplı olduğu.

3. Çeyrek 4 sonucu ortaya çıkan göz kapağı "petaled" çiçek gibi yapı

1. Göz Göz yuvası açılması vücudunuza dik olacak şekilde yerleştirilmiş olmalıdır. 45 ° forseps, kararlı ve pozisyon Vizör adaptör kullanın.
2. Önünde yaylı makas Holding bu yüzden vücudunuza dik yaylı makas alt bıçak, açık göz fincan üst kenarına yerleştirin. 45 ° forseps kullanarak dikkatli bir şekilde, bir tek, düz kesim optik sinir başı doğru corneo-skleral ayrımı yapılabilir böylece göz fincan hizalayın. Tüm kesimler corneo-skleral bölmek için dik olmalı ve belirtilmediği sürece, içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın gitmek gerekir.
3. Vücudunuzun dikliğini koruyarak, Göz yuvası 180 ° döndürün. Ikinci bir dik kesim yapmak için 3.2 adımı tekniği kullanın.
4. Göz yuvası çevirin ve iki tane daha kesimler yapmak için 3.2 'de açıklanan tekniği tekrarlayın. Tüm dört kesimler dışında 90 ° mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bazı farklılıklar bulunmaktadır olacak kadar gözü mükemmel bir küre olmadığını aklınızdan çıkarmayın.

4. Sekiz yapraklı bir çiçek gibi bir yapı içinde, yarım her dört "yaprakları" Kes

1. 35mm çanak temiz bir slayt dörde Göz yuvası aktarın. Göz yuvası yukarı bakacak şekilde, 45 ° forseps ile altında kepçe. Sıvı dikkatlice dışarı çıkarın ve temiz bir slayt üzerine yerleştirin.
2. Açılı forseps iki çifti kullanarak, yavaşça yukarı bakacak şekilde nöral retina ile göz açmak. ÇIKARMAYIN SİNİR Retina-buna karşı değildir bu yüzden göz küre şeklini bazı korumak yardımcı olur. Ayrıca, aşağıdaki yordamları kazara zarar görmesini RPE korur.
3. Slayt yaprakları bir vücudunuzun dik olana kadar çevirin.
4. 15 ° forseps yavaşça petal köşe kapmak. Petal köşesinde değil, nöral retina veya RPE kornea olmalıdır. Onun eğrilik korumak için izin köşesinde hafifçe yukarı kaldırın.
5. Petal ve slayt arasında yaylı makas alt bıçak yerleştirin. Makas kadar satır, bir tek, düz, dik kesme, optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek yapılabilir. Içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın kesin. Gidelimslaytta yalan sağlayan taç yaprağı.
6. Slayt 90 ° döndür, sonraki petal vücudunuza dik olacak şekilde. 4,5 adımı tekrarlayın.
7. Bunu iki kez daha adım 4.5 ve 4.6 tekrarlayın. Ortaya çıkan yapı, sekiz yapraklı bir çiçek gibi görünmelidir.

5. Nöral retina çıkarın

1. Pipet 100-200 mcL numune üzerine 1X PBS. Bu nöral retinanın RPE soyulması gibi yapışmasını önleyecektir.
2. Genellikle nöral retina gevşek RPE eklenir. Ancak, sadece nöral retina ve RPE kaldırmak için uygulama ve beceri sürer. Açılı forseps diğer çift göz (basılı tutarak) geri kalanı stabilize bir çift açılı forseps ile yavaşça nöral retinanın bir taç yaprağı kavramak. Nöral retina gözün geri kalanı uzakta çekin. Tüm nöral retina kaldırıldı kadar bu işleme devam edin. * İpucu: göz çapa optik sinir başı 15 ° forseps ucu sopa. Sonra nöral retina altına süpürüyor 45 ° forseps kullanımı ve kapalı asansör ve. Nöral retina, corneo skleral bölmek doğru optik sinir başı kaldırmak için en iyi genellikle. Iris herhangi bir gevşek kalıntıları çekmeye emin olun. Iris oldukça yapışkan ve aksi RPE sıkışmış alabilirsiniz.
3. 1X PBS ile örnek durulayın. Pipet 100-200 numune içine 1X PBS mcL ve yedekleme emmek. PBS atın. Toz ve enkaz kaldırmak için gerekli tekrarlayın.

6. Bir slayt Mount numune (ler)

1. Pipet 80-90 mcL dikdörtgen şeklinde yeni bir slayt üzerine% 90 gliserol. Gliserol, hatta bir dikdörtgen karalama yapmak için pipet ucu tarafında kullanın. (Bu bir slayt iki RPE montaj için bir işlemdir.)
2. , Örnek altında 15 ° forseps alt kolu takın. Diseksiyon slayt kapalı örnek yavaşça kaldırın.
3. Gliserol içine yavaşça örnek daha düşüktür. Yavaşça numune altından onları çekin forseps wiggle.
4. Diğer örnek için 6,1-6,3 adımları tekrarlayın.
5. Uzun kenarı vücudunuzun dik böylece slayt döndürün. Kapak cam tutun 45 ° slayt dokunmadan böylece slayt açı. Dokunmak kadar gliserol smear doğru hareket ettirin. Kapak cam ve slayt arasındaki temas sağlanması, slayt kenarına doğru yavaş yavaş, smear uzak kapak cam taşımak. Slayt, uzun kenarlarında ve kapak cam hizaya böylece paralel. Başparmak ve işaret parmağı arasındaki kapak cam köşelerinden tutun.
6. Diğer taraftan 15 ° forseps Pick up. Üst (ücretsiz) kol Crook kapak cam kenarına Cradle. Çok yavaş, kapağı cam düşüktür. Kapak cam ve gliserol arasındaki temas yapıldığında, durdurma ve gliserol geçirmek için bekleyin. Bu düşürücü ve RPE bütün bağlar tamamen kaplıdır kadar bekleyen tekrarlayın. Bu hava kabarcıkları yakalamak oldukça viskoz gliserol önlemek için. COVERGLASS aşağı doğru itin VERMEYİN - gliserol yapışma çok zayıf altında sıkmak.
7. Açık oje, kapak cam ve slayt karşılamak çevresinde boya.
8. Kuruması için boş bir raf üstünde slayt yerleştirin.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu prosedürün sonucu, bir çiçek gibi görünüyor ve oldukça simetrik olmalıdır bir yapı olmalıdır.

Şekil 1. Tüm montaj RPE wild tip C67Bl/6J fare, siyah veya agouti hayvanların gelen RPE koyu kahverengi renkli olmalı ve pürüzsüz bir yüzeye sahip olmalıdır . Bu yaprakları topografya dalgalı fark normaldir. Verecek herhangi bir numune üzerinde pigmentasyon RPE ve altta yatan koroid hem değişken pigmentasyon yoğunluğu nedeniyle biraz değişken olabilir. Beyaz oklar hipopigmente "kanallar" noktası - Bu normal bir durumdur ve göz altında yatan damarsal nedeniyle. RPE ve altta yatan koroid hem fiziksel hasar Mavi ok puan.

Şekil 2. Seyreltilmiş fare Tüm montaj RPE. Seyreltik hayvanlardan elde edilen hasat Örnekler café au lait neredeyse saydam renk değişebilir ve herhangi bir örnek siyah daireler burada belirtilen, içinde değişkenlik olması gibi. Genel olarak, genç hayvanlardan elde edilen hasat RPE, daha hafif ve yaşlı hayvanlarda hasat koyu. Siyah oklar hipopigmente görünen altta yatan damarsal bazı göstermektedir.

Şekil 3. Phalloidin boyama RPE fiziksel hasar tespit etmek için kullanılabilir. Phalloidin boyama hücre açıkça özetliyorepitelin altıgen şekil gösteren membranlar. (A) siyah bir fare örneği. (B) seyreltilmiş fare örneği.

Şekil 4. Seyreltilmiş fare kötü disseke RPE (A) Parantezler ve / veya katlama burkulma neden olabilir korneanın çok geniş marjları gösterir. Siyah bir daire içinde gözün arka kaldırıldı gereksiz doku aşırı miktarda görebilirsiniz. Örnek seyreltik bir hayvan çünkü özellikle açıktır. Sol alt taç yaprağı kısmen katlanmış. (B) Tüm bu montaj bir fırıldak bir görünüme sahiptir. Siyah oklar yapılmış olan bazı kesim göstermektedir. Birçok optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek kesim çapı ile uyumlu değildir. (C) Siyah oklar keser teğet çapı ve dik doğrultusunda yapılmış olmalıdır nasıl göstermektedir.

Tartışmalar

RPE bir homoloji yönettiği onarım in vivo tayininde, p ^un testin sitesidir. P ^un tahlil homoloji yönettiği onarım sıklığı üzerine etkileri farklı DNA zararların ^1,2 ve DNA hasarı sinyalizasyon ve onarım genleri ^3,4,5 incelemek için kullanılır olmuştur. Bu testte, ^RPE 1 tek hücreli olaylar tespit son derece duyarlıdır. Ayrıca homoloji yönettiği onarım olayların gelişimi ⁶ sırasında zamanlama farklılıkları ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
straight forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4903	tip: .08 x .04 mm material: INOX
45° forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	tip: .05 x.01 mm material: INOX
15° "up" forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045A	tip: .1 x.06 mm material: INOX
spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5604	comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel
binocular dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	Discovery V.8	use reflected light source
phalloidin	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546