解剖鼠标眼的视网膜色素上皮的全山

摘要

解剖一只老鼠眼的一个正式的示范，导致在整个视网膜色素上皮的坐骑。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）是哺乳动物的眼睛后面，刚下的视网膜神经元，其中包含的光感受器（杆和视锥细胞）。色素上皮是单层联营密切的正上方的神经视网膜色素立方细胞和。这种关联使视网膜色素上皮对视网膜疾病的研究极大兴趣。的RPE也是一个同源DNA修复， ^联合国的 P检测体内检测站点。鼠标的眼睛是特别困难的解剖，由于其体积小（直径约3.5毫米）和球形形状。本文演示了详细的剥离导致眼睛在整个视网膜色素上皮安装程序。在此过程中，我们将展示如何工作对眼睛的球形结构，而不是的。简言之，结缔组织，肌肉，和视神经从眼球后部。然后，角膜和晶状体将被删除。下一步，战略裁员，在重大其余组织的扁平化的结果。最后，视网膜神经轻轻地升空，揭示了一个完整的视网膜色素上皮，这仍然是连接到底层脉络膜和巩膜。这整个挂载可用于执行^联合国的 P检测或免疫组化或免疫视网膜色素上皮组织的评估。

研究方案

1。删除多余的组织，从外面的眼睛

1. 一个35mm的培养皿的盖子，倒入1X PBS。水平应略低于盖子的唇。
2. 直钳，转让眼（S）的存储管使用的35mm盘。眼睛被淹没在PBS的原因有两个：1。多余的组织将“漂浮”，从眼睛，这样​​你可以看到轻松删除它们，和2。在清扫，眼睛自然会保持球形，而处于悬浮状态，让您的工作而不是反对这种形状。
3. 都对使用直角钳（45 °和15 °），轻轻取出尽可能多的肌肉和结缔组织，拉动对粮食的组织（即向着角膜）。一些结缔组织将保持不变。应作出努力，以尽可能少的挤压眼球。
4. 春天剪刀贸易15 °钳。按住眼睛的稳定与45 °钳，使用弹簧剪刀剪去余下的肌肉和结缔组织，以及视神经。 *提示：使用外边缘的剪刀，以推动对粮食组织（朝corneo巩膜鸿沟），然后修剪。继续，直到所有多余的组织已经从眼睛中删除。

2。取下的角膜和晶状体

1. 角膜朝上，使用45 °钳，捏在角膜中心的小褶皱。
2. 使用Spring的剪刀，让一个小切口，在皮瓣的基础。让我们去的皮瓣。
3. 控股的眼睛仍然与您的镊子，剪刀刀片插入较低的和垂直的切口，并削减向corneo巩膜鸿沟。尽量使你的下刀片，所以下的虹膜角膜和虹膜切开。不要削减一路corneo巩膜鸿沟。保持剪刀插在眼睛上。
4. 使用45 °钳，小心地转动眼睛，使你的剪刀平行corneo巩膜鸿沟，使一小截。慢慢转动眼球360 °，使小切口周围所有的方式。再次，尽量保持较低的弹簧剪刀刀片，使下虹膜虹膜和角膜切开。电梯的虹膜和角膜离眼睛休息和丢弃。
5. 在其一侧倾斜的眼睛和对眼睛的后半部轻轻下压，迫使镜头。丢弃的镜头。剩下的眼罩内两旁是由神经视网膜，这看起来应该光滑，不透明。

3。季眼罩，造成4 - “petaled”，花状结构

1. 眼睛应定位眼罩开幕是你的身体垂直。使用45 °钳稳定和位置眼罩。
2. 在你面前的弹簧剪刀，所以他们是垂直你的身体中，将其插入顶边开放眼罩弹簧剪刀的刀片。使用45 °钳，小心地将眼罩，使一个单一的，直切可走向视神经头corneo巩膜鸿沟。所有伤口应垂直corneo巩膜的鸿沟，除非指定的，应该没有到它切割尽可能靠近视神经头的。
3. 眼罩180 °旋转，与你的身体保持垂直。在步骤3.2中使用的技术，进行第二次垂直切割。
4. 旋转眼罩和重复3.2的技术，使两个多削减。所有四个削减应尽可能接近90 °尽可能。请记住，映入眼帘的是不完美的球形，因此会有一些变异。

4。切成两半的四个“花瓣”，在八个花瓣状结构

1. 将驻扎眼罩，从35毫米盘到一个干净的幻灯片。朝上的眼罩，舀下45 °钳。小心地将其取出液体放在一个干净的幻灯片。
2. 使用直角钳都对，轻轻打开了眼，神经视网膜朝上。不删除神经视网膜它有助于眼睛保持球形，这样你就不会反对。它还在以下过程中被意外损坏保护视网膜色素上皮。
3. 旋转滑动，直到花瓣之一是你的身体垂直。
4. 使用15 °钳，轻轻抓住花瓣的角落。花瓣的角落应角膜，神经视网膜或视网膜色素上皮。角落里轻轻抬起，允许它保留其曲率。
5. 插入底部的刀片之间的花瓣和幻灯片的春天剪刀。行了你的剪刀等，可以从一个单一的，直线，垂直切割corneo巩膜鸿沟走向视神经头。削减非常接近，尽可能的withou视神经头吨削减到它。让花瓣，允许它在幻灯片上的谎言。
6. 旋转滑动90 °，使未来的花瓣是你的身体垂直。重复步骤4.5。
7. 重复步骤4.5和4.6两次以上。由此产生的结构应该看起来像一个八瓣花。

5。取出视网膜神经

1. 移液器100-200μL的1X PBS到标本。这将防止从坚持为你的视网膜色素上皮剥离的视网膜神经。
2. 视网膜神经通常是松散连接的RPE。但是，它采取的做法和技能，以去除神经视网膜的RPE。轻轻抓住直角钳一对视网膜神经花瓣，同时稳定（按住），直角钳的另一对眼睛休息。将视网膜神经远离眼睛休息。继续此过程，直到整个神经视网膜已被删除。 *提示：坚持到视神经头15 °钳尖锚眼睛。然后用45 °钳扫下方视网膜神经和抬离和距离。它通常是最好的解除神经视网膜视神经头走向corneo巩膜鸿沟。可以肯定的，绝尘而去的虹膜任何松动的残余。虹膜是很粘，否则可以卡住的RPE。
3. 用1X PBS冲洗标本。移液器100-200μL的1X PBS标本和吸备份。丢弃的PBS。必要时重复来清除灰尘和碎片。

6。你在幻灯片装入标本（S）

1. 吸取80-90μL，90％的甘油长方形到一个新的幻灯片。使用枪头方矩形均匀，甘油涂抹。 （这是一张幻灯片上安装两个视网膜色素上皮的过程。）
2. 插入的下臂下的标本15 °钳。轻轻抬离标本解剖幻灯片。
3. 缓慢地降低到甘油的标本。轻轻摆动的钳为你拉他们从下标本。
4. 重复步骤6.1-6.3其它标本。
5. 旋转滑动，使长边垂直于你的身体。按住玻璃盖在一个45度角到幻灯片，这是动人的幻灯片。走向甘油涂抹，直到他们接触。玻璃盖和幻灯片之间保持联系，慢慢地移动远离涂抹的玻璃盖，走向边缘的幻灯片。最多的幻灯片的长边和玻璃盖，使他们是平行的。握住你的拇指和食指之间的玻璃盖的四角。
6. 在另一只手拿起15 °钳。摇篮上（免费）边在玻璃盖的臂弯。很慢，低的玻璃盖。当接触之间的玻璃盖和甘油，甘油迁移停止并等待。重复此降低，并等待，直到RPE整个坐骑完全覆盖。这是为了防止从捕捉气泡的高粘度的甘油。不推盖玻片 - 甘油会挤压下，使得附着力很差。
7. 有了明确的指甲油，油漆各地的外围玻璃盖和幻灯片的满足。
8. 放置在一个空架干之上的幻灯片。

7。代表性的成果：

此过程的结果应该是一个结构，看起来像一朵花，应该是相当对称。

图1。整个安装的RPE从一个野生型C67Bl/6J鼠标 ，从黑色或刺豚鼠动物的视网膜色素上皮应该是深褐色，并应具有光滑的表面。花瓣的地形起伏是正常的通知。对任何给定的标本的色素沉着可能会有所变化，由于变密度的RPE和底层脉络膜的色素沉着。白色箭头指向色素减退的“渠道” - 这是正常的是，由于眼睛的基本血管。蓝色箭头指向物理损坏的视网膜色素上皮和基本脉络。

图2。整装稀鼠标的RPE。收获稀动物标本的范围可以从几乎透明的颜色的Cafe au Lait和任何一个标本是想在它的可变性，在这里的黑色圆圈表示。在一般情况下，从年幼的动物收获的视网膜色素上皮的重量更轻，从年纪较大的动物收获是较深。黑色箭头指示的一些底层的血管，出现色素减退。

图3。鬼笔环肽染色可以用来检测身体损害的RPE。鬼笔环肽染色清晰地勾勒出的细胞膜，上皮六角形。 （一）例如，从一个黑色的鼠标。 （二）例如，从稀鼠标。

图4。从稀释的小鼠解剖不当的视网膜色素上皮 （A）括号表示角膜的边缘太宽，这可能会导致屈曲和/或折叠。在黑色圆圈中，你可以看到尚未从后面的眼睛中删除的多余组织的过度。他们尤为明显，因为样本是从稀动物。左下角的花瓣是部分折叠。 （b）本整装风车的外观。黑色箭头表示一些削减作了。 corneo巩膜鸿沟走向视神经头的削减，很多都不是直径。 （三）如何削减已取得的直径和垂直切线，黑色箭头表示。

讨论

视网膜色素上皮是^联合国的 P检测的站点，在体内的同源性定向修复检测。 ^联合国的 p检测已用于研究不同的DNA损伤^的影响 ，1,2和频率上的同源性定向修复DNA损伤信号^和修复基因3,4,5。此实验是非常敏感的检测单细胞活动的RPE ^1。它也可以检测^到 6在开发过程中的同源性定向修复事件的时间差异。鼠眼径向向外发展视神经^7，<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
straight forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4903	tip: .08 x .04 mm material: INOX
45° forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	tip: .05 x.01 mm material: INOX
15° "up" forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5045A	tip: .1 x.06 mm material: INOX
spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5604	comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel
binocular dissecting microscope	Carl Zeiss, Inc.	Discovery V.8	use reflected light source
phalloidin	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546