الاصبع العصا منهجية أخذ عينات من الدم لتحديد بممارسة المستحثة الأبوطوزيس اللمفاويات

Summary

ممارسة قادر على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. هناك حدود القياس المختلفة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل التقييم. تظاهر هو إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية.

Abstract

هو ممارسة التحفيز الفسيولوجية قادرة على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. حتى الآن ، وقد تم تحديد أوجه القصور المختلفة مع قياس هذه الظاهرة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل تقييم موت الخلايا. وبسبب هذا ، فمن الصعب تحديد ما إذا كان يمكن ساهمت الزيادات التي أعلن عنها في موت الخلايا المبرمج للخلايا المناعية الأثر الفعلي لممارسة على النظام ، أو هي انعكاس للوقت وتجهيزها في نهاية المطاف من الضروري الحصول على هذا القياس. في هذه المقالة أن نبرهن إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية. خلافا لغيرها من التقنيات ، إضافة إلى الدم الكامل وحة الضد فور الحصول على العينة. بعد فترة الحضانة ، وlysed خلايا الدم الحمراء ومستعدون عينات لتحليلها. استخدام إجراء المعاينة الاصبع العصا يقلل من حجم الدم المطلوبة ، ويقلل من عدم الراحة لمواضيع.

Protocol

1. الإصبع عصا الدم أخذ العينات

1. عادة ما يتم اتخاذ مجموعة من الدم الكامل في بقية لقياس خط الأساس (عادة بعد 10-15 دقيقة بقية الجذور) ، أثناء أو بعد المباراة على الفور وممارسة ، وطوال فترة ما بعد العملية (عادة من 1-3 ساعات بعد وقف ممارسة الرياضة).
2. باستخدام الاحتياطات العالمي ، تعقيم لأول مرة مع الإصبع ايزوبروبيل 70 ٪.
3. المقبل ، ثقب موقع باستخدام مشرط الآلي أو جهاز مماثل. على الرغم من أننا استخدام مشرط عيار 30 لتوفير الراحة للموضوع ، يمكن استخدام إبرة أكبر قياس.
4. يمسح أول قطرة من الدم ، ومن ثم جمع الدم في أنابيب أو الشعرية microvettes تعامل مع الهيبارين لمنع تخثر الليثيوم.

2. Phenotyping الخلية وموت الخلايا المبرمج يلطخ

1. أضف 10 ميكرولتر من الدم الكامل heparinized إلى لوحة الضد titred في المخزن 250 ملزم ميكرولتر (انظر الجدول 1 التخطيطي). وقد استخدمنا عامل إضعاف 01:20 مع النجاح ، ولكن ينبغي لكل مختبر عيار الكواشف لتحديد الحل الأفضل العمل.
   لوحة جسم الجدول 1. لتحديد ممارسة النشاط موت الخلايا المبرمج في مجموعات فرعية الكريات البيض. وقد تم تعريف الخلايا في وقت مبكر عن طريق التعبير عن Annexin الخامس ، في حين تم تحديد الخلايا في وقت متأخر عن طريق وضع العلامات الايجابية مزدوجة مع Annexin V و 7 AAD. وكانت الخلايا نخرية Annexin V - 7 - وAAD + الخلايا فقط.
   

   أنبوب 1	أنبوب 2	أنبوب 3	أنبوب 4
   خلايا أنبوب فقط	Annexin V -- FITC	Annexin V -- FITC	Annexin V -- FITC
   	الإنسان CD4 المضادة -- PE	CD8 المضادة البشرية -- PE	مكافحة الإنسان CD19 -- PE
   	7 - AAD	7 - AAD	7 - AAD
   	CD45RA المضادة البشرية -- APC	CD45RA المضادة البشرية -- APC

   
   7 - 7 - AAD = أمينية أكتينوميسين D ، APC = Allophycocyanin ، CD4 = مساعد الخلايا اللمفية تي ، CD8 = الخلايا اللمفية تي القامع / السامة للخلايا ، CD19 = باء الخلايا اللمفية ، CD45RA خلية ساذجة = فرعية ، FITC ثيوسيانات فلوريسئين = = PE فيكوإيريترين.
2. يحضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
3. الطرد المركزي في 1075 x ج لمدة 5-10 دقائق.
4. صب ، إضافة 300 ميكرولتر خلايا الدم الحمراء الاحتياطي تحلل ، وتماما الدوامة.
5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
6. إضافة 300 ميكرولتر لوقف برنامج تلفزيوني RBC تفاعل تحلل.
7. الطرد المركزي في 1075 x ج لمدة 5-10 دقائق.
8. صب ، رف ، وإضافة 50 ميكرولتر العازلة ملزمة.
9. تحليل من قبل التدفق الخلوي.

فمن المستحسن أن كحد أدنى ، يمكن الاستفادة من الضوابط التالية : أ الخلايا أنبوب فقط لتكون بمثابة الشاهد السلبي في الكشف عن تألق ذاتي الخلفية ، والأنابيب التي تحتوي على كل فرد ملون تألقي لتعيين التعويض الأولي خلال إعداد للتدفق عداد الكريات. بالإضافة إلى ذلك ، فقد استخدمنا حبات معيار التعويض بنجاح لاقامة تجاربنا.

Discussion

وأظهر جمع العينات مينيملي الداخلي والتحليل اللاحق لتحليل كل من المراحل المبكرة والمتأخرة من ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية. ومن الممكن أيضا أن تستبعد بوضوح تلك الخلايا ، والتي هي نخرية ، وأفكارك لا. هذا الإجراء يتغلب على السلبيات وعدم الراحة المرتبطة بزل الوريد ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometry Binding Buffer		eBioscience	00-4222-26
RBC Lysis Buffer		eBioscience	00-4333-57
Lancet Device	Accu Check Soft Touch	Roche Group
Capillary tubes	Heparinized Capillary Tubes	Chase Scientific Glass, Inc.	501
Centrifuge	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC Conjugated		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE Conjugated	Anti-human, clone RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE Conjugated	Anti-human, clone OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE Conjugated	Anti-human, clone HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD Viability Staining Solution		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC Conjugated	Anti-human, clone HI100	eBioscience	17-0458-42
Flow cytometer	C6	Accuri