Finger-палки забора крови Методология определения Упражнение вызванных лимфоцитов Апоптоз

Резюме

Физические упражнения способны индуцировать апоптоз клеток иммунной системы. Существуют различные ограничения измерения, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до проведения оценки. Продемонстрированный является быстрым и минимально инвазивные процедуры для анализа упражнения-индуцированного апоптоза лимфоцитов.

Аннотация

Упражнение физиологические стимулы способны вызывать апоптоз клеток иммунной системы. На сегодняшний день различные ограничения были выявлены с измерением этого явления, особенно в отношении количества времени, необходимого для изоляции и лечения крови до оценку гибели клеток. Из-за этого, трудно определить, является ли сообщили об увеличении апоптоза клеток иммунной могут быть внесены в реальный эффект физических упражнений на системы, или являются отражением времени и обработки необходимо получить в конечном итоге это измерение. В этой статье мы демонстрируем быстрое и минимально инвазивные процедуры для анализа вызванная осуществлением лимфоцитов апоптоза. В отличие от других методов, цельной крови добавляют антитела панели сразу же после получения образца. После инкубационного периода, красные кровяные клетки лизируются и образцы готовы для анализа. Использование пальца придерживаться процедуры отбора образцов, уменьшает объем крови необходимо, и свести к минимуму неудобства для предметов.

протокол

1. Finger-Stick забора крови

1. Коллекция цельной крови, как правило, принято на отдых для базовых измерений (обычно после 10-15 мин сидя покоя), во время или сразу после упражнений боя, и во всем после упражнений период (как правило, от 1-3 часов после прекращения упражнения).
2. Использование универсальных мер предосторожности, первый стерилизовать пальца с 70% изопропилового спирта.
3. Далее прокол сайт с помощью автоматизированной ланцет или аналогичного устройства. Хотя мы используем 30-калибр ланцет для обеспечения теме комфорта, большие иглы могут быть использованы.
4. Сотрите первую каплю крови, а затем собирать крови в капиллярах или microvettes получавших литий гепарина для предотвращения свертывания крови.

2. Фенотипирование клеток и апоптоз Окрашивание

1. Добавьте 10 мкл гепаринизированной цельной крови titred панели антител в 250 мкл буфера для связывания (см. таблицу 1 схема). Мы использовали фактор 1:20 разбавления успех, но каждая лаборатория должна титр их реагентов для определения наилучшего рабочего раствора.
   Таблица 1. Антитела панель для определения упражнения-индуцированного апоптоза лейкоцитов подмножеств. Ранний апоптоз была определена выражением Аннексин V, в то время как поздний апоптоз был определен двойной положительный маркировки с Аннексин V и 7-AAD. Некротические клетки Аннексин V-и 7-AAD + клеток только.
   

   Труба 1	Tube 2	Труба 3	Труба 4
   Клетки только трубки	Аннексин V - FITC	Аннексин V - FITC	Аннексин V - FITC
   	Антивирус правам CD4 - PE	Антивирус правам CD8 - PE	Антивирус правам CD19 - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Антивирус правам CD45RA - APC	Антивирус правам CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-амино-актиномицин D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Помощник Т-лимфоцитов, CD8 = подавитель / цитотоксических Т-лимфоцитов, CD19 = В-лимфоцитов, CD45RA = подмножества наивные клетки, FITC = Fluorescein изотиоцианата, PE = фикоэритрин.
2. Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
3. Центрифуга на 1075 мкг в течение 5-10 минут.
4. Декантировать, добавьте 300 мкл эритроцитов Лизис буфера и тщательно вихря.
5. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
6. Добавить 300 мкл PBS, чтобы остановить лизиса реакции.
7. Центрифуга на 1075 мкг в течение 5-10 минут.
8. Декантировать, стойки, и добавить 50 мкл буфера для связывания.
9. Анализ с помощью проточной цитометрии.

Рекомендуется, как минимум, следующие элементы управления быть использованы: клетки только трубки в качестве отрицательного контроля в выявлении фоне аутофлюоресценция и пробирки, содержащие каждый флуорохромом установить компенсацию во время начальной настройки потока цитометр. Кроме того, мы использовали бисер компенсации стандартных успешно, чтобы сопоставить наши эксперименты.

Обсуждение

Малоинвазивных Пример процедуры сбора и последующего анализа показано, для анализа как ранние и поздние фазы вызванная осуществлением лимфоцитов апоптоза. Кроме того, можно четко исключить те клетки, которые являются некротические, а не апоптоза. Эта процедура позволяет преодолеть н?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometry Binding Buffer		eBioscience	00-4222-26
RBC Lysis Buffer		eBioscience	00-4333-57
Lancet Device	Accu Check Soft Touch	Roche Group
Capillary tubes	Heparinized Capillary Tubes	Chase Scientific Glass, Inc.	501
Centrifuge	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC Conjugated		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE Conjugated	Anti-human, clone RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE Conjugated	Anti-human, clone OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE Conjugated	Anti-human, clone HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD Viability Staining Solution		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC Conjugated	Anti-human, clone HI100	eBioscience	17-0458-42
Flow cytometer	C6	Accuri