Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

Resumo

O exercício é capaz de induzir a apoptose em células do sistema imunológico. Existem limitações de medição diversos, particularmente relacionadas com a quantidade de tempo necessário para isolar e tratar uma amostra de sangue antes da avaliação. Demonstrado é um procedimento rápido e minimamente invasivo para a análise do exercício apoptose induzida por linfócitos.

Resumo

Exercício é um estímulo fisiológico capaz de induzir a apoptose em células do sistema imunológico. Até à data, várias limitações foram identificadas com a medição deste fenômeno, particularmente em relação à quantidade de tempo necessário para isolar e tratar uma amostra de sangue antes da avaliação da morte celular. Devido a isso, é difícil determinar se os aumentos relatados em apoptose de células imunes podem ser contribuíram para o efeito real do exercício sobre o sistema, ou são um reflexo do tempo e de processamento necessário para, eventualmente, obter esta medida. Neste artigo vamos demonstrar um procedimento rápido e minimamente invasivo para a análise da apoptose induzida pelo exercício de linfócitos. Ao contrário de outras técnicas, o sangue total é adicionado a um painel de anticorpos imediatamente após a obtenção de uma amostra. Após o período de incubação, as hemácias são lisadas e as amostras estão prontas para serem analisados. O uso de um procedimento de amostragem ponta de dedo reduz o volume de sangue necessário, e minimiza o desconforto para o indivíduo.

Protocolo

1. Dedo-Stick coleta de sangue

1. Coleta de sangue total é normalmente tomadas em repouso por uma base de referência (normalmente após 10-15 min de repouso sentado), durante ou imediatamente após uma sessão de exercícios, e durante todo o período pós-exercício (geralmente de 1-3 horas após a interrupção do exercício).
2. Utilizando precauções universais, primeiro esterilizar a ponta do dedo com 70% de álcool isopropílico.
3. Punção, próximo do local usando uma lanceta automatizado ou dispositivo similar. Apesar de usarmos uma lanceta de calibre 30 para fornecer para o conforto assunto, uma agulha de maior calibre podem ser utilizados.
4. Limpe a primeira gota de sangue, e depois coletar sangue em tubos capilares ou microvettes tratados com heparina de lítio para prevenir a coagulação.

2. Fenotipagem de células e de coloração Apoptose

1. Adicionar 10 mL de sangue heparinizado inteiro para painel de anticorpos titred em 250 mL de buffer de ligação (ver esquema tabela 1). Nós temos usado um fator de diluição de 1:20 com sucesso, mas cada laboratório deve titre seus reagentes para determinar a melhor solução de trabalho.
   Tabela painel de anticorpos 1. Para a determinação de exercício na apoptose induzida por subconjuntos de leucócitos. Apoptose precoce foi definido pela expressão de anexina V, enquanto apoptose tardia foi definida pela rotulagem positiva duplo com anexina V e 7-AAD. Células necróticas foram anexina V e 7-AAD + apenas células.
   

   Tubo 1	Tubo 2	Tubo 3	Tubo de 4
   Células do tubo só	Anexina V - FITC	Anexina V - FITC	Anexina V - FITC
   	Anti CD4 humanos - PE	Anti Humanos CD8 - PE	Anti Humanos CD19 - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Anti Humanos CD45RA - APC	Anti Humanos CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-Amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfócitos T helper, linfócitos CD8 = supressoras / citotóxicas T, CD19 = B linfócitos, CD45RA = subpopulações de células ingênuo, FITC = isotiocianato de fluoresceína, PE = Ficoeritrina.
2. Incubar a temperatura ambiente no escuro por 30 minutos.
3. Centrifugar a 1075 xg por 5-10 minutos.
4. Decantar, adicionar 300 mL de sangue Red Tampão de Lise Celular, e completamente vortex.
5. Incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
6. Adicionar 300 mL PBS para parar RBC reação de lise.
7. Centrifugar a 1075 xg por 5-10 minutos.
8. Decantar, rack, e adicionar 50 mL de buffer de ligação.
9. Analisar por citometria de fluxo.

Recomenda-se que, no mínimo, os seguintes controles ser utilizados: um tubo de células apenas para servir como controle negativo na detecção de autofluorescência de fundo, e os tubos contendo cada um fluorocromo para definir a compensação durante a configuração inicial do citômetro de fluxo. Além disso, temos utilizado com sucesso contas de compensação padrão para configurar nossos experimentos.

Discussão

Um procedimento de coleta de amostra e minimamente invasiva posterior análise é demonstrado para a análise das fases precoce e tardia da apoptose induzida pelo exercício de linfócitos. Também é possível excluir aqueles claramente células, que são necróticas, e não apoptóticas. Este procedimento supera os inconvenientes e desconforto associado a punção venosa invasoras da região antecubital em momentos múltiplos antes, durante e imediatamente após o exercício, ou conseguir um cateter para a duração d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometry Binding Buffer		eBioscience	00-4222-26
RBC Lysis Buffer		eBioscience	00-4333-57
Lancet Device	Accu Check Soft Touch	Roche Group
Capillary tubes	Heparinized Capillary Tubes	Chase Scientific Glass, Inc.	501
Centrifuge	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC Conjugated		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE Conjugated	Anti-human, clone RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE Conjugated	Anti-human, clone OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE Conjugated	Anti-human, clone HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD Viability Staining Solution		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC Conjugated	Anti-human, clone HI100	eBioscience	17-0458-42
Flow cytometer	C6	Accuri