Egzersizle indüklenen Lenfosit Apoptoz belirlenmesi için parmak sopa Kan Örnekleme Metodolojisi

Özet

Egzersiz immün hücrelerinde apopitoz indükleyen yeteneğine sahiptir. Özellikle önce değerlendirilmesi için kan örneği izole etmek ve tedavi etmek için gerekli süreyi ile ilgili çeşitli ölçüm sınırlamaları vardır. Göstermiştir egzersize bağlı lenfosit apoptozis analizi için hızlı ve minimal invaziv bir işlemdir.

Özet

Egzersiz bağışıklık hücrelerinin apoptozisi indükleyen yeteneğine fizyolojik bir uyarı. Bugüne kadar, özellikle hücre ölümü değerlendirme öncesinde kan örneği izole etmek ve tedavi etmek için gerekli süreyi ile ilgili çeşitli sınırlamalar, bu fenomenin ölçümü ile tespit edilmiştir. Bu nedenle, immün hücre apoptozis artar, sistem üzerinde egzersiz gerçek etkisi katkıda veya bu ölçüm sonunda elde etmek için gerekli zaman ve işleme bir yansıması olup olmadığını belirlemek zordur. Bu yazıda, egzersize bağlı lenfosit apoptozis analizi için hızlı ve minimal invaziv bir prosedür ortaya koymaktadır. Diğer tekniklerin aksine, tam kan, hemen bir örnek elde etmek üzerine bir antikor paneline eklenir. Kuluçka döneminin ardından, kırmızı kan hücrelerinin parçalanmış ve numuneler analiz edilecek hazırız. Bir parmak-stick örnekleme prosedürü kullanmak gerekli kan hacmini azaltır ve konulara rahatsızlığı en aza indirir.

Protokol

1. Parmak-Stick Kan Örnekleme

1. Tam kan toplanması genellikle kesildikten sonra (genellikle 1-3 saat sırasında bazal ölçüm (genellikle 10-15 dk oturan geri kalanı aşağıdaki), veya bir egzersiz nöbeti hemen ardından, egzersiz sonrası dönem boyunca dinlenme alınır egzersiz).
2. Evrensel Önlemler kullanarak, önce parmak ucu% 70 izopropil alkol ile sterilize edin.
3. Sonra, delinme, otomatik bir neşter veya benzeri bir cihaz kullanarak site. Biz tabi konfor sağlamak için 30-gauge neşter kullanmalarına rağmen, daha büyük bir iğne yararlanılabilir.
4. Ilk kan damlası uzak silin ve sonra da kan pıhtılaşmasını önlemek için lityum heparin ile tedavi, kılcal tüpler veya microvettes içine toplamak.

2. Hücre fenotipleme ve Apoptoz Boyama

1. 250 mcL bağlayıcı tampon titred antikor paneli (bkz. Tablo 1 şematik) 10 mcL heparinize tam kan ekleyin. Biz başarı ile 1:20 seyreltme faktörü var, ama her laboratuar için en iyi çalışma çözümü belirlemek için reaktifler titre.
   (Tablo 1). Lökosit altkümelerini egzersiz apoptosis belirlenmesi için antikor paneli. Geç apoptozis Annexin V ve 7-AAD çift pozitif etiketleme tarafından tanımlanan iken erken apoptozis, Annexin V ifadesi ile tanımlanmıştır. V-7-AAD + hücreler nekrotik hücreler Annexin edildi.
   

   Tüp 1	Tüp 2	Tüp 3	Tüp 4
   Hücreler sadece tüp	Annexin V - FITC	Annexin V - FITC	Annexin V - FITC
   	Anti İnsan CD4-PE	Anti İnsan CD8 - PE	Anti İnsan CD19-PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Anti İnsan CD45RA - APC	Anti İnsan CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-Amino-aktinomisin D, APC = Allophycocyanin, CD4 yardımcı T lenfositler, CD8 = Bastırıcı / sitotoksik T lenfositler, CD19 = B lenfositleri, CD45RA = naif hücre alt grupları, FITC = Floresein izotiyosiyanat, PE = Fikoeritrin.
2. Karanlık oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
3. 5-10 dakika 1075 xg'de santrifüjleyin.
4. Durusu, 300 mcL Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tampon ekleyin ve iyice girdap.
5. 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
6. RBC parçalama reaksiyonu durdurmak için 300 mcL PBS ekleyin.
7. 5-10 dakika 1075 xg'de santrifüjleyin.
8. Durusu, raf ve 50 mcL bağlayıcı tampon ekleyin.
9. Flow sitometri ile analiz edin.

Sadece tüp arka plan otofloresans saptanmasında bir negatif kontrol olarak hizmet etmek için bir hücre, her bireyin içeren tüplere ve akış sitometresinin ilk sırasında tazminat ayarlamak için florokrom: en azından aşağıdaki denetimleri kullanılan olması tavsiye edilir. Buna ek olarak, bizim deneyler kurmak için tazminat standart boncuk başarıyla kullanmıştır.

Tartışmalar

Minimal invaziv bir örnek toplama işlemi ve sonraki analiz egzersize bağlı lenfosit apoptozis hem erken ve geç faz analizi için gösterilmiştir. Bu açıkça nekrotik ve apoptotik değil bu hücrelerin, dışlamak için de mümkündür. Bu işlem sırasında, önce birden fazla zaman noktalarında antekübital bölgede invaziv venipunktür ile ilgili sakıncaları ve rahatsızlık üstesinden ve egzersizden hemen sonra ya da egzersiz maçın süresi için bir kateter güvence. Araştırmacılar açısından, bu t...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometry Binding Buffer		eBioscience	00-4222-26
RBC Lysis Buffer		eBioscience	00-4333-57
Lancet Device	Accu Check Soft Touch	Roche Group
Capillary tubes	Heparinized Capillary Tubes	Chase Scientific Glass, Inc.	501
Centrifuge	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC Conjugated		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE Conjugated	Anti-human, clone RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE Conjugated	Anti-human, clone OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE Conjugated	Anti-human, clone HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD Viability Staining Solution		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC Conjugated	Anti-human, clone HI100	eBioscience	17-0458-42
Flow cytometer	C6	Accuri