Finger-stick Metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti

Riepilogo

L'esercizio fisico è in grado di indurre l'apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ci sono limitazioni concernenti le misure varie, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione. È dimostrata una procedura rapida e mini-invasiva per l'analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti.

Abstract

L'esercizio fisico è uno stimolo fisiologico in grado di indurre l'apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ad oggi, diverse limitazioni sono state identificate con la misura di questo fenomeno, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione della morte cellulare. A causa di questo, è difficile stabilire se un aumento segnalato in apoptosi delle cellule immunitarie possono essere contribuito l'effetto reale di esercizio del sistema, o un riflesso del tempo e di elaborazione necessaria per ottenere alla fine questa misura. In questo articolo si dimostra una procedura rapida e mini-invasiva per l'analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti. A differenza di altre tecniche, il sangue intero viene aggiunto a un pannello di anticorpi immediatamente dopo l'ottenimento di un campione. Dopo il periodo di incubazione, i globuli rossi vengono lisati ed i campioni sono pronti per essere analizzati. L'uso di un dito-stick procedura di campionamento riduce il volume di sangue richiesto, e riduce al minimo il disagio ai soggetti.

Protocollo

1. Finger-Stick prelievo di sangue

1. Raccolta di sangue intero è di solito presi a riposo per una misura di base (di solito dopo 10-15 resto seduto min), durante o immediatamente dopo un attacco di esercizio, e per tutto il periodo post-esercizio (in genere da 1-3 ore dopo la cessazione del esercizio fisico).
2. Utilizzando le precauzioni universali, in primo luogo sterilizzare la punta del dito con il 70% di alcool isopropilico.
3. Successivamente, la puntura il sito utilizzando un bisturi automatici o dispositivi simili. Anche se si usa un 30-gauge bisturi per offrire il comfort soggetto, un ago di diametro più ampio potrebbero essere utilizzati.
4. Eliminare la prima goccia di sangue, e poi raccogliere in provette di sangue capillare o microvettes trattati con litio eparina per prevenire la coagulazione.

2. Fenotipizzazione delle cellule e colorazione apoptosi

1. Aggiungere 10 microlitri di sangue intero eparinizzato al pannello di anticorpi titolati in 250 microlitri di buffer vincolanti (vedi tabella 1 schema). Abbiamo usato un fattore di diluizione 1:20 con successo, ma ogni laboratorio dovrebbe titolo i loro reagenti per determinare la migliore soluzione di lavoro.
   Tabella 1. Pannello di anticorpi per la determinazione di esercizio apoptosi indotta in sottoinsiemi dei leucociti. Apoptosi precoce è stato definito mediante l'espressione di annessina V, mentre l'apoptosi in ritardo è stato definito con un doppio etichettatura positiva con annessina V e 7-AAD. Le cellule necrotiche erano annessina V e 7-AAD + solo le celle.
   

   Provetta 1	Provetta 2	Tubo 3	Tubo 4
   Solo le cellule del tubo	Annessina V - FITC	Annessina V - FITC	Annessina V - FITC
   	Anti CD4 umano - PE	Anti umane CD8 - PE	Anti umani CD19 - PE
   	7-AAD	7-AAD	7-AAD
   	Anti umani CD45RA - APC	Anti umani CD45RA - APC

   
   7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfociti T helper, CD8 = soppressore / linfociti T citotossici, i linfociti B CD19 =, CD45RA = sottopopolazioni cellulari ingenuo, FITC = isotiocianato di fluorescina, PE = ficoeritrina.
2. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
3. Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti.
4. Decantare, aggiungere 300 ul Red Cell Lysis Buffer sangue, e completamente vortice.
5. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
6. Aggiungere 300 ml di PBS per fermare la reazione di lisi.
7. Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti.
8. Decantare, rack, e aggiungere 50 microlitri di buffer vincolanti.
9. Analizzare mediante citometria di flusso.

Si raccomanda, come minimo, i seguenti controlli da utilizzare: un solo tubo di cellule per servire come controllo negativo nel rilevare autofluorescenza sfondo, e le provette contenenti ciascuno fluorocromo per impostare compensazione durante l'impostazione iniziale della citometria a flusso. Inoltre, abbiamo utilizzato perline standard di compensazione con successo per creare i nostri esperimenti.

Discussione

Un mini-invasiva procedura di raccolta dei campioni e successiva analisi è dimostrato per l'analisi delle fasi sia precoce e tardiva di esercizio apoptosi indotta da linfociti. E 'anche possibile escludere con chiarezza quelle cellule, che sono necrotico, e non apoptotica. Questa procedura risolve gli inconvenienti ed il disagio associato a venipuntura invasiva della regione antecubitale in momenti diversi, prima, durante e immediatamente dopo l'esercizio o attribuisce un catetere per tutta la durata della ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometry Binding Buffer		eBioscience	00-4222-26
RBC Lysis Buffer		eBioscience	00-4333-57
Lancet Device	Accu Check Soft Touch	Roche Group
Capillary tubes	Heparinized Capillary Tubes	Chase Scientific Glass, Inc.	501
Centrifuge	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC Conjugated		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE Conjugated	Anti-human, clone RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE Conjugated	Anti-human, clone OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE Conjugated	Anti-human, clone HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD Viability Staining Solution		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC Conjugated	Anti-human, clone HI100	eBioscience	17-0458-42
Flow cytometer	C6	Accuri