手指棒运动诱导淋巴细胞凋亡的测定血液抽样方法

摘要

锻炼是能诱导免疫细胞凋亡。有各种测量的局限性，特别是有关的评估之前，隔离和治疗血液样本所需的时间。证明是一个快速运动诱导淋巴细胞凋亡的分析和微创手术。

摘要

运动能诱导免疫细胞凋亡是一种生理刺激。种种限制，迄今为止，已确定这种现象的测量，尤其是有关的细胞死亡的评估之前，隔离和治疗血液样本所需的时间。正因为如此，它是难以确定是否增加免疫细胞凋亡的报道可以促进运动对系统的实际效果，或反映了必要的时间和处理，最终获得此测量。在这篇文章中，我们展示了运动诱导淋巴细胞凋亡分析一个快速和微创手术。与其他技术不同的是，全血立即被添加到抗体面板后，获得一个样品。潜伏期之后，红血细胞裂解样品准备进行分析。手指棒抽样程序的使用减少了所需的血​​液量，最大限度地减少科目的不适。

研究方案

1。手指沾采血

1. 休息时通常采取的收集全血为基准测量（通常是10-15分钟坐下休息），期间或之后立即行使回合，和整个运动后期间（一般1-3小时以下停止练习）。
2. 使用通用的预防措施，首先消毒，用70％异丙醇的指尖。
3. 下一步，穿刺网站使用自动柳叶刀或类似设备。虽然我们使用30号的柳叶刀为主题的舒适，较大的针头可利用。
4. 擦去第一滴血，然后收集到毛细管或锂肝素治疗，以防止凝血microvettes的血液。

2。细胞表型和细胞凋亡染色

1. 加入10μL肝素化全血250μL结合缓冲液的滴度抗体面板（见表1原理）。我们已经成功地使用1:20稀释因子，但每个实验室应滴定试剂，以确定最好的工作方案。
   表1。运动诱导细胞凋亡的白细胞亚群测定抗体面板。早期凋亡Annexin V的表达，而晚期凋亡Annexin V和7 - AAD双正面标签中定义的界定。坏死细胞的膜联蛋白V -和7 - AAD +细胞只。
   

   管1	管2	管3	管4
   细胞管	膜联蛋白V - FITC	膜联蛋白V - FITC	膜联蛋白V - FITC
   	抗人CD4 - 体育	抗人CD8 + - PE	抗人CD19 - PE
   	7 - AAD	7 - AAD	7 - AAD
   	抗人CD45RA - APC	抗人CD45RA - APC

   
   7 - AAD = 7 - 氨基放线菌素D，APC =变藻蓝蛋白，CD4 +辅助性T淋巴细胞，CD8 +抑制性/细胞毒性T淋巴细胞，CD19 + = B淋巴细胞，CD45RA + =幼稚细胞亚群，FITC异硫氰酸荧光素，PE =藻红蛋白。
2. 在室温下在黑暗中孵育30分钟。
3. 离心机在1075 XG为5-10分钟。
4. 倒出，加300μL红血细胞裂解液，彻底旋涡。
5. 在室温下孵育15分钟。
6. 添加300μLPBS停止红细胞裂解反应。
7. 离心机在1075 XG为5-10分钟。
8. 倒出，机架，并添加50μL结合缓冲液。
9. 流式细胞仪分析。

这是建议，至少以下控制利用：仅管作为一个背景自体荧光检测阴性对照的一个细胞，每一个人荧光管设置在流式细胞仪的初步赔偿。此外，我们已经使用了补偿标准珠，成功地建立我们的实验。

讨论

一种微创的样品收集过程和随后的分析表明运动诱导淋巴细胞凋亡的早期和晚期阶段的分析。它也可以明确地排除那些坏死，并没有凋亡的细胞，这是。此过程克服的弊端，从肘地区侵入静脉穿刺，在多个时间点之前相关的不适，期间和运动后即刻或安全行使回合期间导管。在调查中，这类程序通常需要放血，并非所有个人的专门培训。此外，受招聘和保留使用此过程预计将增强，从而增加了发?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow Cytometry Binding Buffer		eBioscience	00-4222-26
RBC Lysis Buffer		eBioscience	00-4333-57
Lancet Device	Accu Check Soft Touch	Roche Group
Capillary tubes	Heparinized Capillary Tubes	Chase Scientific Glass, Inc.	501
Centrifuge	GmC Lab	Gilson, Inc.	PMS-880
Annexin V-FITC Conjugated		Biovision Inc.	K201-400-1
CD4-PE Conjugated	Anti-human, clone RPA-T4	eBioscience	12-0049-42
CD8-PE Conjugated	Anti-human, clone OKT8	eBioscience	12-0086-73
CD19-PE Conjugated	Anti-human, clone HIB19	eBioscience	12-0199-42
7-AAD Viability Staining Solution		eBioscience	00-6993-50
CD45RA-APC Conjugated	Anti-human, clone HI100	eBioscience	17-0458-42
Flow cytometer	C6	Accuri