قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Summary

الليستريا المستوحدة هو كائن نموذج لدراسة الاستجابات المناعية والقابلية الوراثية لبكتيريا الخلايا في الفئران. هذه الطريقة تمكن واحد لقياس الحمولة الجرثومية وتولد وحيدة الخلية تعليق الكبد والطحال من الفئران لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد التغييرات في الخلايا المناعية بسبب عدوى الليستيريا.

Abstract

الليستريا المستوحدة (الليستريا) هو اختياري الممرض إيجابية الجرام الخلايا ^1. دراسات الماوس توظف عادة الحقن في الوريد ليستيريا ، مما يؤدي في حالات العدوى النظامية ^2. بعد الحقن ، والليستيريا تنشر بسرعة الى الكبد والطحال نتيجة لامتصاص الخلايا الجذعية CD8α ⁺ وخلايا كوبفر ^3،4. phagocytosed مرة واحدة ، والبروتينات البكتيرية المختلفة تمكين الليستيريا للهروب من يبلوع ، البقاء داخل العصارة الخلوية ، وتصيب الخلايا المجاورة ^5. خلال الأيام الثلاثة الأولى من العدوى ، ومختلف خلايا المناعة الفطرية (مثل الوحيدات ، العدلات ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والخلايا الجذعية) توسط الآليات التي تقلل من انتشار جراثيم الليستريا. CD8 ⁺ يتم تعيينهم في وقت لاحق ، والخلايا التائية المسؤولة عن إزالة الألغام في نهاية المطاف الليستيريا من المضيف ، وعادة في غضون 10 يوما من الإصابة ^6.

التخليص الناجح ليستيريا من الفئران المصابة يتوقف على ظهور استجابات مناسبة المضيف المناعي ^6. هناك طائفة واسعة من الحساسيات بين السلالات الفطرية ^7،8 الماوس. عموما ، الفئران مع زيادة التعرض للعدوى الليستيريا هي أقل قدرة على السيطرة على انتشار الأسلحة الجرثومية ، مما يدل على زيادة الحمولة الجرثومية و / أو إزالة تأخر بالمقارنة مع الفئران المقاومة. وقد حددت الدراسات الجينية ، بما في ذلك تحليلات الربط وسلالات الفأر خروج المغلوب ، والجينات المختلفة التي تؤثر على تسلسل تباين ردود المضيفة للعدوى الليستيريا ^6،8-14. تقرير ومقارنة بين حركية عدوى سلالات مختلفة الماوس وبالتالي وسيلة هامة لتحديد العوامل الوراثية المضيفة التي تسهم في الاستجابات المناعية ضد الليستيريا. المقارنة بين استجابات المضيف لسلالات مختلفة الليستيريا هو أيضا وسيلة فعالة لتحديد عوامل الفوعة الجرثومية التي قد تكون اهدافا محتملة للعلاج بالمضادات الحيوية أو تصميم لقاح.

نحن هنا وصف طريقة واضحة لقياس الحمولة الجرثومية (وحدات تشكيل مستعمرة [كفو] في النسيج) وإعداد وحيدة الخلية تعليق الكبد والطحال لتحليل FACS الاستجابات المناعية في الفئران المصابة الليستيريا. هذه الطريقة مفيدة بصفة خاصة لتوصيف الأولية للعدوى الليستيريا في سلالات الفأر الرواية ، وكذلك المقارنة بين الاستجابات المناعية بين سلالات مختلفة الماوس المصابين الليستيريا. نستخدم المستوحدة الليستيريا EGD السلالة ^{ال 15} التي والمعارض عندما أغار على تربيتها في الدم ، وهي منطقة هالة مميزة حول كل مستعمرة بسبب انحلال الدم β - ¹ (الشكل 1). ويمكن تحديد الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية عند أي نقطة في الوقت بعد الإصابة التي زراعة الأنسجة جناسة على لوحات أجار الدم وإعداد المعلقات خلية للتحليل الأنسجة FACS باستخدام البروتوكولات المذكورة أدناه. فإننا نلاحظ أن الأفراد الذين المناعة أو الحوامل يجب ألا تعامل الليستيريا ، وينبغي استشارة المؤسسية ذات الصلة بالسلامة الأحيائية لجنة إدارة المرافق والحيوان قبل بدء العمل.

Protocol

1. زراعة وطويلة الأجل تخزين الليستيريا المستوحدة (الليستريا)

1. صنع أو شراء مسبق الصنع آغار الدم الحصان (HBA) لوحات. لوحات الجافة قبل استخدامها من قبل تفرخ المسبق عند 37 درجة مئوية خلال الليل أو في وضع كشف التدفق الصفحي مجلس الوزراء لمدة 1 ساعة.
2. الحصول على الليستيريا قابلة للحياة من واحدة من ما يلي : وضع الأنسجة المصابة جناسة الماوس ، مجفف بالتجميد مخزون ، مخزون الجلسرين المجمدة ، أو مستعمرة من ثقافة الليستيريا الأخيرة (أي أقل من أسبوع واحد من العمر وليس شبه مثقف اكثر من 10 أجيال) . وينبغي الحصول على جميع الليستيريا باستخدام حلقة عقيمة وتوظيف التقنيات بتلقيح العقيم لجميع الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول.
3. الليستيريا متتالية على مدى ربع من سطح اللوحة مع انتشار اللقاح الأساسي : الليستيريا على طبق من HBA كما هو مبين في الشكل 1 باستخدام حلقة عقيمة بتلقيح متتالية. اتخاذ سلسلة من الشرائط من انتشار أحادي الاتجاه الأساسي. كرر streaking 2-3 مرات باستخدام حلقة جديدة أو إعادة تعقيمها ، قبل كل مجموعة من الشرائط. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
4. مخزن الليستيريا HBA لوحة في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها شهر من 1 أو انتقل إلى الخطوة 1.5 لإعداد ثقافة الليستيريا للتخزين الطويل الأجل.
5. اختيار مستعمرة واحدة من ثقافة الليستيريا العذبة على طبق من HBA به حلقة تعقيم وتطعيم تطعيم 10 مل من نقيع القلب الدماغ (بهي) مرق (إعداد وفقا لتعليمات الصانع) في زجاجة 30 مل مكارتني.
6. احتضان ثقافة الليستيريا شاكر في المدار في 180rpm عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
7. إضافة العقيمة الجلسرين 80 ٪ (V / V) لثقافة الليستيريا السائل في نسبة 1:1 للحصول على تركيز الجلسرين النهائي من 40 ٪ (V / V). نقل aliquots 0،5-1 ملم في cryovials وتخزين مخزون الليستيريا / الجلسرين في -70 درجة مئوية.

نصائح وملاحظات :

• ويمكن دعم نمو الليستيريا على وسائط غير انتقائية مختلفة ، مثل مجموعة من آغار الدم (تستكمل مع الأغنام والخيول والخنازير الغينية أو الدم البشري) ، والدماغ ضخ القلب (بهي) أجار أو مرق ، مرق الصويا أو زيتية مع الخميرة استخراج (TSB - YE). يمكن التقليل من تلوث النمو في الثقافة عن طريق إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام عن السلالات المقاومة للمضادات الحيوية الليستيريا مع تعريف (على سبيل المثال المستوحدة L. 10403S) ، أو باستخدام وسائل الإعلام أكسفورد ، والتي تدعم بشكل انتقائي من نمو الليستيريا.
• إذا تم الحصول عليها من مصدر الليستيريا لم تختبر ، فمن المستحسن أن يتم إجراء اختبارات إضافية لتأكيد هوية الليستيريا (L. المستوحدة إيجابية الجرام ، وعدم تشكيل بوغ ، متحركة في <30 درجة مئوية ، واللاهوائية facultatively الإيجابية الكاتلاز ، و أكسيداز سلبية). ويمكن أيضا الحصول على ثقافة أن تنمو في وسائل الإعلام الانتقائي الليستيريا لضمان الحصول على ثقافة نقية.
• التجفيف لوحات HBA يضمن أن هناك فصل الأمثل للمستعمرات الجرثومية على طبق من ذهب.
• عند اتخاذ الجلسرين الاسهم المجمدة ليستيريا ، استخدم الطازجة HBA الليستيريا الثقافات التي هي أقل من 1 في الاسبوع القديمة وشبه مثقف من أجل الأجيال وأقل عدد ممكن (<5 هو أفضل).
• عندما المستمدة من الثقافات الليستيريا الطازجة المجمدة بمخزون الجلسرين ، ينبغي بذل مرور أول المتوسطة الصلبة (أي لوحات HBA) لان الليستيريا تم الحصول عليها من مخزونات الجلسرين المجمدة تنمو بشكل سيئ عندما subcultured مباشرة في وسط السائل.

2. إعداد وتخزين المخزون المعدية ليستيريا في الدراسات المجراة العدوى

1. الليستيريا متتالية من الأسهم المجمدة الجلسرين (الخطوة 1.7) على لوحة HBA كما هو موضح في الخطوة 1.3. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل لاستخدامها في اليوم التالي.
2. اختيار مستعمرة واحدة من ثقافة الليستيريا متتالية وتطعيم من 10 مل مرق بهي. تجنب نقل أجار في المرق.
3. احتضان ثقافة بهي الليستيريا شاكر في المدار عند 180 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى منتصف المرحلة لوغاريتمي (OD600 = ~ 0.4). هذا عادة ما يستغرق 3-4 ساعات.
4. اتخاذ قسامة 0.9 مل جو معقم و مطهر والحصول على القراءة في 600 نانومتر OD في 3-4 ساعات من الاهتزاز. إذا OD القراءة <0.3 ، ثم متابعة للثقافة في شاكر المداري في 180 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى القراءة OD غير ~ 0.4.
5. إضافة 1 مل العقيمة الجلسرين 80 ٪ (V / V) إلى 10 مل الليستيريا ثقافة مرق بهي (OD600 ~ 0.4). المزيج برفق ونقل إلى 1.5 مل في أنابيب microfuge aliquots مل 0،5-1.
6. ضع aliquots على الجليد لمدة 10 دقيقة وتخزينها في -70 درجة مئوية. ترك إحدى قسامة رفع التجميد لتحديد تركيز الليستيريا في المخزون المعدية ، والذي هو عادة في حدود 10 ⁹ CFU / مليلتر.
7. أداء 01:10 التخفيفات التسلسلي للunfroزن الأسهم المعدية الليستيريا في برنامج تلفزيوني لتخفيف ^-8 10. انتشار 100 ميكرولتر من غير مخفف والتخفيف اللاحقة على كل لوحات HBA قبل المجفف (الخطوة 1.1) مكررة في استخدام رش الزجاج. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
8. حساب عدد المستعمرات في كل لوحة وتحديد تركيز الليستيريا ثقافة الأسهم المجمدة المعدية باستخدام العملية الحسابية التالية : التركيز (CFU / مل) = عدد من المستعمرات × معامل التخفيف / 0.1 مل. وينبغي على لوحات مختارة لحساب ومثالي 3-30 المستعمرات لضمان وجود تقدير موثوق به لتركيز CFU من البكتيريا قادرة على البقاء.
9. بعد أيام قليلة من تخزين الأوراق المالية في الليستيريا المعدية -70 درجة مئوية ، وذوبان الجليد من أنبوب واحد. تحديد تركيز الليستيريا قابلة للحياة كما هو موضح في الخطوات 2.7 و 2.8. هذا يجب أن يكون هناك تركيز مماثل لذلك الذي للسهم المعدية الطازجة في الخطوة 2.8.

نصائح وملاحظات :

• يتم تجميد الأسهم المعدية الليستريا في الجلسرين نسبة أقل (8 ٪) من ليستيريا المجمدة للتخزين طويل الأجل العامة (40 ٪).
• تجميد أرصدة المعدية الليستيريا وعادة ما تكون مستقرة عند -70 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. إذا باستخدام تتجاوز 3 أشهر ، فمن المستحسن أن يكون مستعدا على مخزون جديد من ثقافة المعدية الليستيريا العذبة على طبق من HBA.
• إذا كان تركيز المخزون إذابة المعدية الليستيريا (الخطوة 2.9) يختلف عن المخزون الطازجة كما هو موضح في الخطوات 2.7 و 2.8 (أي تراجع> 20 ٪ في CFU) ، ثم يجب أن تكون على استعداد جديد الأسهم المعدية المجمدة.
• على الرغم من الوقت أكثر مما تستهلك في البداية إعداد اللقاح الجرثومي جديدة لتجربة واحدة ، وإعداد تجميد الأرصدة المعدية الليستيريا يمكن تحديد دقيق للتركيز CFU قبل العدوى والاتساق بين أفضل التجارب عند الفئران المصابة من المخزون المجمدة نفسه.

3. إعداد اللقاح الليستيريا والحقن في الوريد من الفئران

1. تحديد تركيز الليستيريا ليتم حقنه في الماوس. للحقن في الوريد ، ويستخدم في 200 CFU قيحة ميكرولتر في الماوس.
2. أذاب بإجراء قسامة المجمدة من الأسهم المعدية الليستيريا (من الخطوة 2.6). تمييع الأسهم المعدية في برنامج تلفزيوني لتركيز CFU الليستيريا المطلوب. مضاعفة حجم اللازمة لحقن كل الفئران للتأكد من أن هناك ما يكفي من اللقاح للحقن وتصميم الليستيريا CFU قبل وبعد حقن (الخطوة 3.3 و 3.7).
3. إزالة 2X 0.1 مل من aliquots قيحة والليستيريا إعدادها ، وإعداد برنامج تلفزيوني في التخفيف 1:10 لكل قسامة قبل حقن الفئران. الصفيحة 0.1 مل من كل تخفيف HBA على لوحات ، واحتضان لوحات ليلا 37 درجة مئوية. حساب عدد المستعمرات وتحديد ما قبل حقن تركيز قيحة الليستيريا : التركيز (CFU / مل) = (عدد من المستعمرات × معامل التخفيف) / مل مطلي لتخفيف هذا العامل.
4. نقل الماوس ليتم حقنه في قفص نظيفة. الحارة الماوس عن طريق وضع القفص ~ 50 سم تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء 250 واط لمدة 5 دقائق (غيرها من الأجهزة الحرارية المناسبة التي لن تحرق الماوس أو زيادة درجة حرارة فوق 40 درجة القفص ويمكن أيضا أن تستخدم C). ضع الماوس في جهاز حقن الوريد لكبح الذيل.
5. المزيج برفق تعليق الليستيريا للحفاظ على وقف ثابت في كل مرة يتم تحميل حقنة.
6. تحديد موقع الوريد الذيل الأفقي للفأرة ، يمسح برفق مع الايثانول 70 ٪ ومسح تضخ 200 ميكرولتر من قيحة الليستيريا (على التركيز المطلوب) باستخدام المحاقن مع إبرة قياس 27. تطبيق الضغط لفترة وجيزة جرح الدخول مع شاش معقم. عودة الماوس لقفصه.
7. عندما يتم الانتهاء من حقن الفئران جميع ، كرر الخطوة 3.3 باستخدام المبلغ المتبقي من اللقاح لتحديد تركيز بعد حقن اللقاح الليستيريا.
8. وذكرت وكمية ضخ الليستيريا في الفئران كما CFU متوسط ​​تحدد من قبل وبعد حقن عينات قيحة الليستيريا.

نصائح وملاحظات :

• نحن عادة لضخ 500 -- 3000 CFU (200 ميكرولتر من 2500 كفو / مل -- 15000 كفو / مل قيحة) عند مقارنة الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية بين سلالة مقاومة للماوس (على سبيل المثال C57BL / 6) وسلالة الماوس الحساسة (مثل BALB / ج ).
• إذا كان سيتم المخفف للسهم المعدية في برنامج تلفزيوني على الأقل 10 ⁵ ، ثم ليست خطوة الغسيل المطلوبة لإزالة وسائل الإعلام عموما المتبقية / الجلسرين. إذا لن يكون السهم المخفف المعدية في برنامج تلفزيوني على الأقل 10 ⁵ ، ثم يجب أن تضاف خطوة الغسيل في الخطوة 3.2 لإزالة بقايا وسائل الاعلام / الجلسرين كما يلي :د 9 مل PBS لإذابة مخزون المعدية والبكتيريا التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي في 2100 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وطاف إزالة resuspend الخلايا البكتيرية مكعبات في 10 مل العقيمة PBS ، كرر الطرد المركزي ، وresuspend الخلية البكتيرية بيليه في حجم المطلوب. تحديد CFU متوسط ​​من قبل وبعد حقن عينات قيحة الليستيريا كما هو موضح في الخطوة 3.3 و 3.7. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الخطوة قد تؤدي إلى غسل فقدان بعض من البكتيريا ، وينصح بأن يتم تحديد هذه الخسارة مسبقا واستأثرت في صنع اللقاح من التركيز المطلوب.
• تجاهل بأمان المحاقن والإبر بعد حقن الفأر مع الليستيريا.

4. إزالة الكبد والطحال من الليستيريا الفئران المصابة للتحليل

1. Euthanase الفأر المصاب في نقطة الوقت المطلوب العدوى باستخدام أسلوب آخر وافقت عليه اللجنة أخلاقيات الحيوان المحلية ، مثل الاختناق ₂ CO.
2. أداء القلب ينزف على الفور بعد القتل الرحيم باستخدام حقنة 1 مل و 25 إبرة قياس. جمع الدم بقدر المستطاع. إزالة المرارة وقطع الوريد الأجوف السفلي.
3. فضح الوريد البابي الكبدي عن طريق دفع بعناية الأمعاء للحق ، والوجه فصوص الكبد نحو الرأس وإلى اليسار بحيث يجلس الكبد حيث يقع الحجاب الحاجز. في الوريد البابي الكبدي يغذي الجزء السفلي من الكبد من الجانب الأيمن السفلي.
4. يروي الكبد عن طريق الحقن 10 مل PBS في الوريد البابي الكبدي باستخدام إبرة قياس 26. سيكون من خلال برنامج تلفزيوني حقن الوريد البابي الخروج من الوريد الأجوف السفلي مقطوعة. نضح خلايا الكبد يضمن أن يتم حصادها من الكبد وليس الدموية.
5. إزالة الكبد perfused من تجويف الجسم الماوس ، والمكان في FACS العازلة ، وتخزينها على الجليد. انتقل إلى الخطوة 5.1 لإعداد الكبد للتحليل FACS.
6. إزالة الطحال من الماوس ، في مكان FACS العازلة ، وتخزينها على الجليد.
7. وزن الطحال كله ، وقطع النصف ، وتزن أحد النصفين. مكان واحد نصف العازلة FACS والانتقال إلى الخطوة 6.1. وضع النصف الآخر في حقيبة Stomacher على الجليد والانتقال إلى الخطوة 7.1.

نصائح وملاحظات :

• في خطوات 4.5 و 4.6 ، واستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية كافية عازلة ليغرق تماما في النسيج للحد من التعرض لأي جزء من النسيج للهواء.
• ويمكن لنصف بوصة طول إبرة قياس 26 التي يعكف بواسطة 30 درجة ~ تيسير أفضل برنامج تلفزيوني حقن في الوريد البابي الكبدي.
• عندما perfused بشكل صحيح ، والكبد يتحول من اللون الأحمر الداكن إلى البني الفاتح بعد حقن 1-2 مل PBS.
• إذا كان غير مطلوب من الكبد للتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ، نضح ليست ضرورية. يمكن أن تكون معزولة في الكبد وتحصيلها مباشرة في كيس Stomacher ومعالجتها كما هو موضح في الخطوة 7.
• للقتل الرحيم من الفئران ، CO ₂ الخنق هو الأسلوب المفضل لأنه له تأثير ضئيل على CFU البكتيرية وبقاء الخلية المناعة في الطحال والكبد. إذا كان غير مطلوب جمع الدم ، يمكن استخدام خلع عنق الرحم الرحيم كطريقة بديلة. فمن المستحسن أن أساليب القتل الرحيم والتي قد تؤثر وزن الجهاز المناعي أو بقاء الخلية لا يمكن استخدامها (thiobarbiturates مثلا).

5. إعداد تعليق خلية كبدية لتحليل FACS

1. تولد وحيدة الخلية الايقاف عن طريق وضع الكبد مع العازلة FACS (الخطوة 4.5) في الخلية 70 ميكرومتر مصفاة التي يتم داخل طبق بتري 60 مم. دفع الأنسجة من خلال مصفاة الخلية باستخدام المكبس من حقنة 5 مل حتى يتم تشكيل لتعليق وحيد الخلية.
2. نقل الكبد وحيدة الخلية تعليق من طبق بيتري لولبية أنبوب 50 مل غطاء مخروطي الشكل وجلب الحجم الإجمالي إلى 40 مل مع العازلة FACS الباردة.
3. دوامة تعليق الخلية واتخاذ قسامة مل 1 لتحديد الحمولة الجرثومية للكبد. انتقل إلى الخطوة 7.3 و استخدام هذا قسامة مل 1 في مكان جناسة الأنسجة في كيس Stomacher.
4. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، resuspend بيليه في 40 مل العازلة FACS الباردة ، بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 XG ل5min في 4 درجات مئوية ، وتجاهل طاف.
5. Resuspend الكرية خلية في Percoll 20 مل متساوي التوتر في درجة حرارة الغرفة. تعليق الطرد المركزي في الخلية 700 x ج لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رفض ورقة وطاف مثل قرص من الخلايا ، تطفو على أعلى (أي خلايا الكبد). Resuspend الكرية الكريات البيض التي تحتوي على 4 العازلة TAC مل ليز لكريات الدم الحمراء وخلايا يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 دقيقة مع انعكاس متكررة.
6. تعليق تصفية الخلية عبر غشاء النايلون 100 ميكرون إلى 10 مل أنبوب جديد للطرد المركزي.
7. الأساس الذي تقوم عليه تصفيتها مع 1 تعليق خلية العازلة FCS / مل EDTA. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، وresuspend في 5 العازلة FACS / مل EDTA.
8. تعليق الطرد المركزي في 350 خلية XG لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، وresuspend الخلية بيليه في 0،5-3 العازلة FACS / مل EDTA اعتمادا على حجم الكرية.
9. تمييع الخلية 1:05 حتي 1:20 تعليق باللون الأزرق التريبان اعتمادا على حجم والتعليق في خطوة 5.8. عدد الكريات البيضاء كبدي قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات (الشكل 4A) وتحديد خلايا قابلة للحياة مجموع ما يلي : خلايا قابلة للحياة / الجهاز = عدد الخلايا في المنطقة عامل الفرز تخفيف X X 10 X ⁴ الحجم (مل). ويمكن بعد ذلك الكبد وحيدة الخلية الايقاف يكون المسمى مع الأجسام المضادة المحددة للعلامات سطح الخلية المطلوبة وتحليلها عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية.

نصائح وملاحظات :

• تبقي الخلايا على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.

6. إعداد تعليق الطحال وحيدة الخلية لتحليل FACS

1. تولد وحيدة الخلية الايقاف عن طريق وضع نصف الطحال (الخطوة 4.7) مع العازلة FACS في الخلية 70 ميكرومتر مصفاة التي يتم داخل طبق بتري 60 ملم. دفع برفق الأنسجة من خلال مصفاة الخلية باستخدام المكبس من حقنة 5 مل حتى يتم تشكيل تعليق وحيد الخلية.
2. نقل والطحال وحيدة الخلية تعليق من صحن بيتري لأنبوب الطرد المركزي 10 مل وتقديمهم إلى إجمالي حجم 10 مل باستخدام الباردة FACS العازلة.
3. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل ، resuspend طاف بيليه في الخلية 4 العازلة TAC مل ليز لكرات الدم الحمراء ، وخلايا يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 دقيقة مع انعكاس متكررة.
4. تعليق تصفية الخلية عبر غشاء النايلون 100 ميكرون إلى 10 مل أنبوب جديد للطرد المركزي.
5. الأساس الذي تقوم عليه تصفيتها مع 1 تعليق خلية العازلة FCS / مل EDTA. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، وresuspend الخلية بيليه في 5 العازلة FACS / مل EDTA.
6. تعليق الطرد المركزي في 350 خلية XG لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية ، وتجاهل طاف ، وresuspend بيليه في الخلية 3-8 العازلة FACS / مل EDTA اعتمادا على حجم الكرية.
7. تمييع 01:10 تعليق الخلية -- 01:20 التريبان في الزرقاء (0.4 ٪ في ماء مقطر) اعتمادا على حجم والتعليق في خطوة 7.6. العد باستخدام عدادة الكريات splenocytes قابلة للحياة -- انظر الخطوة 5.9 لحساب مجموع خلايا قابلة للحياة في تعليق الجهاز الطحال وحيدة الخلية ثم يمكن المسمى مع الأجسام المضادة المحددة للعلامات سطح الخلية المطلوبة وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية.

نصائح وملاحظات :

1. تبقي الخلايا على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.

7. قياس الحمولة البكتيرية في الأنسجة المصابة الليستيريا من الفئران

1. أضعاف أعلى من الحقيبة التي تحتوي على Stomacher النصف الطحال. بينما يمسك الكيس Stomacher أغلقت لمنع التسرب ، وأنها تقع الشقة على مقاعد البدلاء النظيفة أو في مجلس الوزراء تدفق الصفحي. قلم لفة سميكة مستديرة على الأنسجة حتى يتم المهروسة الأنسجة داخل الحقيبة.
2. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني على كل حقيبة تحتوي على نسج Stomacher المهروسة. وضع الكيس في Stomacher Stomacher ، وتشغيل Stomacher على سرعة عالية لمدة 10 دقيقة.
3. مزيج جناسة في الحقيبة Stomacher (أو قسامة 1 مل من تعليق خلية كبدية) مع ماصة. نفذ ما يلي في التكرارات. نقل 300 ميكرولتر إلى لوحة أسفل 96 - جيدا المسطحة. داخل الآبار من لوحة 96 - أداء جيدا 1:10 التخفيفات المتسلسلة (30 ميكرولتر إلى 270 ميكرولتر PBS) إلى التخفيف 10 ^-5 لكل عينة الأنسجة جناسة.
4. انتشار بعناية 0.1 مل من كل تخفيف على طبق من ذهب HBA قبل المجفف باستخدام مفرشة الزجاج. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
5. حساب عدد CFU لكل التخفيف وحساب CFU في الأنسجة مع الأخذ بعين الاعتبار جزء من الأنسجة (مثلا نصف الطحال) ، عامل التخفيف ، وإجمالي حجم جناسة الأنسجة (5 مل مل أو 40) : CFU / الأنسجة = CFU/0.1 مل س س عامل تخفيف مل / الأنسجة ؛ الطحال لتقسيم هذا العدد من وزن النسبة المئوية للعينة المستخدمة في الطحال تجانس النسيج (انظر الخطوة 4.7).

نصائح وملاحظات :

• يمكن وضع أكثر من واحد في كيس Stomacher Stomacher في وقت طالما إجمالي حجم لا يتجاوز حجم الأقصى كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة
• إذا لم يتوفر Stomacher ، يمكن استخدام الخالط الأنسجة بدلا من ذلك. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن الطريقة التالية ، وإن لم تكن فعالة كما يمكن استخدامه لأضعف يدويا الجهاز في مكان من الخطوات 7.1 و 7.2 : الجهاز ضعها في حقيبة بلاستيكية مغلقة معقمة ووضع على مقاعد البدلاء النظيفة بينما عقد حقيبة مغلقة لمنع التسرب . مختبر لفة 500 مل زجاجة متكررة على مدى كيس حتى يتم المهروسة جيدا الأنسجة. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني على كل حقيبة ، والشروع في الخطوة 7.3.
• من المهم جدا في الخطوة 7.4 أن يتم تجفيفه جيدا لوحات HBA(أي أي رطوبة على آجار). وإلا فإنه قد يكون من الصعب الحصول على مستعمرات الليستيريا المتميزة التي يمكن الاعتماد بشكل صحيح.
• إذا كانت هناك لوحات HBA محدودة ، وهي خطوة بديلة 7.4 هو : رسم خطوط على الجزء السفلي من لوحة HBA قبل المجفف (الخطوة 1.1) في تقسيمه إلى أقسام 5-6 ، واحد لكل التخفيف. 25 ميكرولتر ماصة بعناية من كل تخفيف في الأجزاء المقابلة على لوحة HBA لكل جناسة الأنسجة -- لا تنتشر مع رش. انتظر حتى قطرات من جناسة الأنسجة جافة قبل بليت قلب. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل. ويمكن تمييز ما يصل الى 80 المستعمرات بسبب قطرة واحدة على صفيحة آغار.
• قد التخفيف من الخليط الأنسجة تعتمد على نمو الليستيريا في الحيوان ، ويمكن أن يقدر على أساس الأعراض التي تظهر على الحيوان في وقت القتل الرحيم. بالنسبة للفئران التي تحتضر بشكل ملحوظ ، ثم قد يكون من الضروري التخفيفات إضافية على نحو أكثر دقة تحديد الحمولة الجرثومية. لتلقيح الفئران بجرعات منخفضة من الليستيريا أو الفئران euthanased في نهاية فترة العدوى ، قد يتم استخدام مخفف جناسة الأنسجة لتحديد الحمولة الجرثومية.
• يمكن المحتضنة لوحات في 37 درجة مئوية خلال الليل أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام.

8. ممثل النتائج :

لعدوى التجربة القياسية ، تم الحصول عليها من المخزون الليستيريا الجلسرين المجمدة ويشوبه على طبق من HBA كما هو مبين في الشكل 1. إذا حصلت المستعمرات بعد بضعة streaking ، قد يشير هذا streaking الفقراء أو أقل من الأسهم المجمدة الأمثل. وقد أعد الأسهم الليستيريا المعدية من لوحة HBA يشوبه طازجة وتخزينها في -70 درجة مئوية. لقياس إزالة البكتيريا والاستجابات المناعية ، ونحن تمييع بشكل روتيني إذابة مخزون المعدية الليستيريا إلى 2500 كفو / مل -- 15000 كفو / مل وحقن الفئران مع 200 ميكرولتر لتصيب منهم مع 500 -- 3000 CFU. نلاحظ أن الفئران المصابة بجرعات قاتلة من الباطن ليستيريا باستخدام هذا البروتوكول قد يحمل عابر الفراء تكدرت ، التقوس في الجلوس وفقدان الوزن في غضون الأيام القليلة الأولى. تقدم هذه الأعراض مؤشرا مرئيا عن كيفية تأثر بشدة ماوس الفردية عن طريق العدوى ، سواء كان يستجيب بشكل مختلف لبقية المجموعة (أي "واضحة" النموذجية) ، وعما إذا كان القتل الرحيم هو ضروري لمنع المعاناة والموت الوشيك المفرطة بسبب الإصابة.

في النتائج التي تمثلها الأرقام 2-5 ، وكانت الفئران المصابة باستخدام قسامة إذابة طازجة من الأسهم الليستيريا المعدية. في نقاط زمنية مختلفة ما بعد الإصابة ، وeuthanased الفئران أزيلت والكبد والطحال. ويبين الشكل 2 لوحة HBA الذي تم تخفيفه مثقف جناسة الطحال من ماوس واحدة. يجب أن يكون هناك انخفاض واضح في عدد من المستعمرات كعامل تخفيف يصبح أعلى ، بحيث عد CFU متميزة من الممكن لاثنين على الاقل من التخفيفات. إذا كان الماوس مسح عدوى الليستيريا (أي حد الاكتشاف = 100 CFU / الأنسجة) ، ثم <5 مستعمرات الليستيريا تكون موجودة على لوحة HBA التي انتشرت مع 200 ميكرولتر من جناسة الأنسجة غير مخفف. إذا كان الكبد و / أو الطحال تصبح ملوثة بالبكتريا المعوية الخارجية أو غيرها من خلال العزلة ، والمستعمرات على لوحة HBA من المرجح أن يحمل مورفولوجية مختلفة (أي لن يكون له هالة مميزة وألوان باهتة من المستعمرات الليستيريا) و / أو أن تكون قد في تهم مختلفة مستعمرة إلى ما هو متوقع ليستيريا (أي قليلة جدا أو كثيرة جدا). الشكل 3 يبين منحنى نموذجي لإزالة الليستيريا الفئران C57BL / 6 -- لاحظ أن يتم مسح الليستيريا عادة بسرعة أكبر من الطحال والكبد وغير ذلك التخليص لا يحدث حتى بعد خمسة أيام من الإصابة.

الشكل 4 يبين عدد الخلايا على أساس وحيد الخلية تعليق المحضرة من الطحال والكبد لدى الفئران المصابة في نقطة زمنية مختلفة بعد العدوى. ويمكن تحقيق هذا الأسلوب> نقاء الكريات البيض 95 ٪ في وحيدة الخلية تعليق المحضرة من الكبد و> 80 ٪ من الطحال. ويمكن تحديد نقاء الكريات البيض عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة علامة محددة لعموم الكريات البيض CD45 (استنساخ 30 - F11). عادة ، وعدد الكريات البيض والكبد splenocytes الزيادة خلال الفترة ما يلزم لمسح العدوى بفيروس الكبد اظهار قدر أكبر من زيادة الكريات البيض أضعاف في الكبد ، ولكن مجموع أصغر بكثير ، مقارنة بزيادة قدرها splenocytes في الطحال. ويمكن تحديد نوع وعدد الخلايا المناعية التي وسم المعلقات وحيدة الخلية مع الأجسام المضادة المحددة لسطح الخلية علامات. ويمكن عندئذ الخلايا المسمى يتم الكشف عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. الشكل 5 يوفر نتائج ممثل عن الخلايا التائية CD8 ^+. خلال عدوى الليستيريا القياسية في الفئران C57BL / 6 ، وعدد الخلايا التائية CD8 ⁺ انخفاض عابر بسبب اللمفاويات في الطحال في befor 2-3 أيامه تزايد بشكل ملحوظ في الفترة من 5 ايام عدوى آخر في الطحال والكبد على حد سواء.

الشكل 1. يشوبه HBA وحة مع الليستيريا. وقد استخدم حلقة عقيمة لتحصين خط الليستيريا من الجلسرين الأسهم المجمدة. والمحتضنة لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل. الهالة المحيطة مستعمرات فردية مميزة يرجع إلى انحلال الدم - β.

الشكل 2. جناسة الأنسجة من ماوس الليستيريا المصابين مثقف على لوحات HBA. وكان حصادها والكبد من C57BL الليستيريا المصابين / الماوس 6 في 3 أيام بعد العدوى. وقد أعد جناسة الأنسجة وتوضع في صفيحة التخفيفات 100 انتشار كامل لمدة 10 ميكرولتر تخفيف ^-4 (أ) و 10 ^-5 تخفيف (B) ، فضلا عن 25 ميكرولتر قطرات على طبق من ذهب لكل HBA التخفيف من 1:10 إلى 10 مخفف ^-5 (C). والمحتضنة لوحات في 37 درجة مئوية خلال الليل. تستخدم التخفيفات التي تمكن عد المستعمرات الفردية لتحديد الحمولة الجرثومية (أي CFU / الأنسجة) عند تلك النقطة مرة بعد الإصابة.

الشكل 3. تحميل الليستيريا في الطحال والكبد لدى الفئران C57BL / 6 المصابين في 3 و 7 أيام بعد العدوى. أصيب C57BL / 6 الفئران مع CFU 2000 ~ من الليستيريا. في كل نقطة زمنية ، تم euthanased الفئران ، تم perfused الكبد والطحال مع المقطوع ، وكان المثقف من التخفيفات جناسة الطحال (A) أو كبدي وحيدة الخلية تعليق (B) على لوحات HBA لتحديد الحمولة الجرثومية. خطوط الصلبة تشير الوسط الهندسي ، وتشير الأعمدة الرأسية SEM. خط منقط يشير إلى أن الحد من الكشف عن القياس الدقيق للتحميل الجرثومي هو 100 CFU / الجهاز لهذه التجربة.

الشكل 4. تعداد خلايا قابلة للأنسجة من الفئران المصابة. أصيب C57BL / 6 الفئران مع CFU 2000 ~ من الليستيريا. في كل نقطة زمنية ، تم euthanased الفئران ، perfused الكبد والطحال مع المقطوع. تم صبغ الخلايا مع التريبان الأزرق وعدها باستخدام عدادة الكريات كما هو موضح في الخطوة 5.9 (A). التهم التي تم الحصول عليها خلية طحالية (B) ، والكريات البيض الكبد (C) من خلية واحدة من المعلقات أعد الليستيريا الفئران المصابة. تشير خطوط الوسط الهندسي.

الشكل 5. FACS تحليل CD8 ⁺ الخلايا التائية في الليستيريا المصابين الفئران. أصيب C57BL / 6 الفئران مع CFU 2000 ~ من الليستيريا. في كل نقطة زمنية ، تم euthanased الفئران ، perfused الكبد والطحال مع المقطوع. تم صبغ وحيدة الخلية المعلقات مع الأجسام المضادة لخلايا محددة T (CD3 ، TCRβ ، CD4 ، CD8). (A) مع الممثل التشكيلات FACS ٪ CD8 ⁺ T خلايا + / -- SEM. (ب) المجموع CD8 ⁺ الخلايا التائية في الطحال. (C) المجموع CD8 ⁺ الخلايا التائية في الكبد.

Discussion

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
حصان الدم آغار قاعدة NO.2	Oxoid	CM0271	إعداد قاعدة لوحات أجار HBA
دم الحصان (مزال الفبرين)	Oxoid	HB1000	إضافة إلى قاعدة 5-10 ٪ أجار
الدماغ ضخ القلب (بهي) مرق (10 مل)	Oxoid	TM456
وسائل الاعلام الدماغ ضخ القلب المجففة	Oxoid	CM1135
96 - جيدا لوحة مسطحة القاع	العلوم البيولوجية دينار بحريني	353072
70 ميكرومتر مصفاة الخلية	العلوم البيولوجية دينار بحريني	352350
طبق بتري الصغيرة	العلوم البيولوجية دينار بحريني	351007
Stomacher 80 biomaster مختبر النظام	سيوارد
أكياس البلاستيك Stomacher	Sarstedt	86 9924 530
ألبومين المصل البقري	سيغما	A3912
FACS العازلة			0.1 ٪ (W / V) ألبومين المصل البقري في برنامج تلفزيوني
متساوي التوتر Percoll (33.75 ٪ في Percoll PBS)	جنرال إلكتريك للرعاية الصحية	17-0891-01	33.75mL Percoll ، 10X 3.75mL PBS ، 62.5mL 1X PBS يجعل 100ML Percoll متساوي التوتر
TAC العازلة			17mM تريس ، 140mM كلوريد الأمونيوم في الماء المقطر
FCS / EDTA العازلة			الجنين مصل العجل مع EDTA 10MM
FACS / EDTA العازلة			FACS عازلة + EDTA 5mM
زرقة التريبان	سيغما	T6146	0.4 ٪ (W / V) في برنامج تلفزيوني ، تصفية تعقيمها
2mL Cryovial	غرينر بيو واحد	121263
حقنة الانسولين gauge/1mL 27	Terumo المنتجات الطبية	SS10M2713
إبرة	Terumo المنتجات الطبية	NN - 2516R (25G 5/8in) NN - 2613R (26G 1/2in)
محقنة	Terumo المنتجات الطبية	SS - 01T (1mL) ، SS - 053 (5mL) ، SS - 10S (10ML)