Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Résumé

Listeria monocytogenes est un organisme modèle pour étudier les réponses immunitaires et une susceptibilité génétique à des bactéries intracellulaires chez les souris. Cette méthode permet de mesurer la charge bactérienne et de générer une seule cellule de suspensions de foie et de rate de souris pour l'analyse de FACS pour déterminer les changements dans les cellules immunitaires dues à l'infection par Listeria.

Résumé

Listeria monocytogenes (Listeria) est un agent pathogène facultatives Gram-positives intracellulaires ^1. Études sur les souris utilisent généralement une injection intraveineuse de la bactérie Listeria, qui se traduit par une infection systémique ^2. Après l'injection, Listeria diffuse rapidement à la rate et du foie due à l'absorption par CD8a ⁺ cellules dendritiques et les cellules de Kupffer ^3,4. Une fois phagocyté, différentes protéines bactériennes permettent d'échapper à la Listeria phagosome, survivre dans le cytosol, et infecter les cellules voisines ^5. Pendant les trois premiers jours de l'infection, différentes cellules immunitaires innées (monocytes, par exemple, les neutrophiles, les cellules NK, cellules dendritiques) arbitrer les mécanismes bactéricides qui minimisent la prolifération de Listeria. Lymphocytes T CD8 ⁺ sont ensuite recrutés et responsable de l'apurement éventuel de Listeria provenant de l'hôte, habituellement dans les 10 jours d'infection ^6.

Dédouanement réussie de Listeria chez les souris infectées dépend de la survenue de réactions appropriées immunitaire de l'hôte ^6. Il ya un large éventail de sensibilités parmi les souches de souris consanguines ^7,8. Généralement, les souris à une susceptibilité accrue aux infections Listeria sont moins capables de contrôler la prolifération bactérienne, démontrant augmentation de la charge bactérienne et / ou une clairance retardée par rapport à des souris résistantes. Des études génétiques, y compris les analyses de liaison et de souches de souris knock-out, ont identifié des gènes différents pour lesquels la variation des séquences affecte réponses de l'hôte à l'infection Listeria ^6,8-14. Détermination et comparaison des cinétiques d'infection entre les différentes souches de souris est donc une méthode importante pour l'identification des facteurs génétiques de l'hôte qui contribuent à la réponse immunitaire contre la bactérie Listeria. Comparaison des réponses de l'hôte à différentes souches de Listeria est également un moyen efficace d'identifier les facteurs de virulence bactériens qui peuvent servir de cibles potentielles pour un traitement antibiotique ou de la conception du vaccin.

Nous décrivons ici une méthode simple pour mesurer la charge bactérienne (unités formant colonie [CFU] par les tissus) et la préparation des suspensions à cellule unique du foie et la rate pour une analyse FACS des réponses immunitaires chez des souris infectées par Listeria. Cette méthode est particulièrement utile pour la caractérisation initiale de l'infection par Listeria dans les souches de souris roman, ainsi que la comparaison des réponses immunitaires entre les différentes souches de souris infectées par la bactérie Listeria. Nous utilisons la bactérie Listeria monocytogenes EGD souche ^15, qui, lorsqu'elles sont cultivées sur gélose au sang, présente une zone halo caractéristique autour de chaque colonie, en raison de β-hémolyse ¹ (figure 1). Charge bactérienne et les réponses immunitaires peuvent être déterminés à tout moment-point après l'infection par homogénat de tissu en culture sur gélose au sang et à la préparation de suspensions de cellules de tissu pour analyse FACS en utilisant les protocoles décrits ci-dessous. Nous tenons à souligner que les personnes qui sont immunodéprimées ou enceintes ne devraient pas manipuler de Listeria, et les institutionnels concernés comité de biosécurité et la gestion de l'animalerie doit être consulté avant le début des travaux.

Protocole

1. La culture de stockage et à long terme de Listeria monocytogenes (Listeria)

1. Faire ou acheter pré-faites à cheval gélose au sang (HBA) plaques. Les plaques sèches avant de l'utiliser en pré-incubation à 37 ° C pendant la nuit ou la mise à découvert dans un hotte à flux laminaire pendant 1 heure.
2. Obtenir Listeria viables de l'un des suivants: une souris infectée homogénat tissulaire, un stock lyophilisé, un stock de glycérol congelés, ou une colonie d'une culture récente de Listeria (soit moins de une semaine vieux et pas de sous-culture de plus de 10 générations) . Tous les Listeria doit être obtenue en utilisant une anse stérile inoculation et employant des techniques aseptiques pour toutes les méthodes décrites dans ce protocole.
3. Streak Listeria sur une plaque adaptateur HBA comme le montre la figure 1 à l'aide d'une anse stérile inoculant: strie Listeria plus ¼ de la surface de la plaque comme la propagation d'inoculum primaire. Faites une série de stries unidirectionnelle de la diffusion primaire. Répétez stries 2-3 fois en utilisant une boucle fraîches ou re-stérilisés avant chaque série de stries. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
4. Magasin de Listeria plaque de HBA à 4 ° C pour une période maximale de 1 mois ou passez à l'étape 1.5 pour préparer la culture de Listeria pour stockage à long terme.
5. Choisissez une seule colonie d'une culture fraîche de Listeria sur une plaque HBA à l'aide d'une boucle d'inoculation stérilisée et inoculer 10 ml de bouillon coeur-cervelle (BHI) (préparer selon les instructions du fabricant) dans une bouteille de 30 ml McCartney.
6. Incuber la culture de Listeria dans un agitateur orbital à 180rpm à 37 ° C pendant la nuit.
7. Ajouter le glycérol stérile à 80% (v / v) à la culture de Listeria liquide à un rapport de 1:1 pour obtenir une concentration finale de glycérol 40% (v / v). Transfert de 0,5 à 1 ml aliquotes dans des cryotubes et à stocker de Listeria / glycérol à -70 ° C.

Conseils & notes:

• La croissance de la Listeria peut être pris en charge sur différents milieux non sélectifs, comme une gamme de gélose au sang (complété avec le cheval, le mouton, la Guinée porc ou le sang humain), infusion coeur-cervelle (BHI) agar ou le bouillon, ou de bouillon trypticase soja avec de la levure extrait (TSB-YE). La croissance contaminant peut être minimisé dans la culture par l'ajout d'antibiotiques aux médias pour les souches de Listeria à la résistance aux antibiotiques définis (par exemple, L. monocytogenes 10403S), ou en utilisant d'Oxford médias, qui sélective soutenir la croissance de la Listeria.
• Si Listeria est obtenu à partir d'une source non vérifiée, il est recommandé que des tests supplémentaires seront effectués pour confirmer l'identité de la bactérie Listeria monocytogenes (L. monocytogenes est Gram positif, non sporulées, immobiles à <30 ° C, anaérobies facultatives, catalase positive, et oxydase négative). La culture obtenue peut aussi être cultivées sur des milieux sélectifs Listeria afin de s'assurer que d'une culture pure est obtenue.
• Le séchage des plaques HBA assure qu'il ya une séparation optimale des colonies bactériennes sur la plaque.
• Lors de stocks de glycérol congelés de Listeria, utilisez cultures fraîches HBA Listeria qui sont moins de 1 semaine et sous-culture pour les générations peu nombreuses que possible (<5 est le meilleur).
• Lorsque vous dérivez cultures fraîches de Listeria provenant d'un stock de glycérol congelé, le premier passage devrait être faite sur milieu solide (c'est à dire plaques HBA), car Listeria obtenus à partir de stocks de glycérol surgelés poussent mal quand ils sont directement repiquées en milieu liquide.

2. Préparation et stockage du matériel infectieux Listeria dans les études in vivo d'infection

1. Streak Listeria provenant d'un stock de glycérol congelé (Étape 1.7) sur une plaque HBA comme décrit dans l'étape 1.3. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit pour une utilisation sur le lendemain.
2. Choisissez une seule colonie de Listeria à partir d'une culture et d'inoculer une série de 10 ml de bouillon BHI. Eviter de transférer agar dans le bouillon.
3. Incuber la culture de Listeria dans les BHI un agitateur orbital à 180 tpm et 37 ° C à la mi-logarithmique phase (DO600 = ~ 0,4). Cela prend généralement 3-4 heures.
4. Prélever une partie aliquote 0,9 mL de manière aseptique et obtenir une lecture de DO à 600 nm à 3-4 heures d'agitation. Si OD lecture est <0,3, puis continuer à la culture dans un agitateur orbital à 180 tpm et 37 ° C jusqu'à ce que la lecture OD est ~ 0,4.
5. Ajouter 1 ml de glycérol stérile 80% (v / v) à 10 ml de culture de Listeria bouillon BHI (DO600 ~ 0,4). Mélanger délicatement et transférer dans des tubes de 1,5 ml dans 0,5 à 1 microcentrifugeuse aliquotes ml.
6. Placer des aliquotes sur la glace pendant 10 min et stocker à -70 ° C. Laisser une aliquote dégelés pour déterminer la concentration de Listeria dans le stock infectieuses, qui est typiquement de l'ordre de 10 ⁹ UFC / ml.
7. Effectuer 1:10 dilutions en série de l'unfrozen stock de Listeria infectieuses dans du PBS à 10 ^-8 dilution. Fais 100 ul de chaque dilution non dilué et ultérieures sur des plaques HBA pré-séché (étape 1.1) en double en utilisant un épandeur de verre. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
8. Comptez le nombre de colonies sur chaque plaque et déterminer la concentration de Listeria de la culture des stocks congelés infectieuses en utilisant le calcul suivant: la concentration (UFC / ml) = nombre de colonies x facteur de dilution / 0,1 ml. Les plaques choisie pour le comptage devrait idéalement avoir de 30 à 300 colonies afin d'assurer une estimation fiable de la concentration UFC de bactéries viables.
9. Quelques jours après le stockage de Listeria stocks infectieuses à -70 ° C, dégeler un tube. Déterminer la concentration de Listeria viables comme décrit dans les étapes 2.7 et 2.8. Cette concentration devrait être similaire à celle déterminée pour le stock fraîchement préparés infectieuses à l'étape 2.8.

Conseils & notes:

• Listeria stocks infectieuses est congelé à une plus faible pourcentage de glycérol (8%) que pour Listeria congelés générale stockage à long terme (40%).
• Frozen Listeria stocks infectieuses sont généralement stables à -70 ° C jusqu'à 3 mois. Si vous utilisez plus de 3 mois, il est recommandé qu'un nouveau stock infectieuses être préparé à partir d'une culture fraîche de Listeria sur une plaque HBA.
• Si la concentration du stock dégelé infectieuses Listeria (étape 2.9) est différent de la souche fraîchement préparés comme décrit dans les étapes 2.7 et 2.8 (ie diminution> 20% en UFC), puis un nouveau stock congelé infectieuses devraient être préparés.
• Bien que le temps initialement plus consommer que de préparer un inoculum bactérienne fraîche pour une expérience unique, préparation congelés Listeria stocks infectieuses permet une détermination précise de la concentration UFC avant l'infection et une meilleure cohérence entre les expériences lorsque les souris sont infectées de la même souche congelée.

3. Préparation de l'inoculum Listeria et l'injection intraveineuse de souris

1. Déterminer la concentration de Listeria doit être injecté par souris. Pour une injection intraveineuse, UFC dans 200 ul par inoculum de la souris est utilisée.
2. Dégeler une aliquote congelé de stock infectieuses Listeria (de l'étape 2.6). Diluer le stock infectieuses dans du PBS à la concentration voulue UFC Listeria. Doubler le volume nécessaire pour l'injection de toutes les souris pour s'assurer qu'il ya suffisamment d'inoculum pour l'injection et la détermination de la bactérie Listeria UFC pré-et post-injection (étape 3.3 et 3.7).
3. Retirer 2x 0,1 mL de l'inoculum préparé Listeria, et de préparer une dilution 1:10 dans du PBS pour chaque partie aliquote avant l'injection des souris. Plate 0,1 ml de chaque dilution sur des plaques HBA, et incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C. Comptez le nombre de colonies et de déterminer la concentration d'injection pré-Listeria de l'inoculum: la concentration (UFC / ml) = (nombre de colonies x facteur de dilution) / ml en plaqué pour ce facteur de dilution.
4. Transfert de la souris pour être injecté dans une cage propre. Chaud de la souris en plaçant la cage ~ 50 cm sous une lampe infrarouge 250 watts pendant 5 min (autres dispositifs thermiques adaptés qui ne brûlent pas la souris ou d'augmenter la température de la cage au-dessus de 40 ° C peut également être utilisé). Placez la souris dans un dispositif de retenue pour les injections veine de la queue.
5. Mélanger délicatement la suspension de Listeria à maintenir une suspension uniforme à chaque fois une seringue est chargé.
6. Localisez la veine latérale de la queue de la souris, essuyer doucement avec un éthanol à 70% essuyez et injecter 200 ul d'inoculum Listeria (à concentration souhaitée) à l'aide d'une seringue avec une aiguille de calibre 27. Brièvement appliquer une pression sur la plaie d'entrée avec une gaze stérile. Retour de la souris dans sa cage.
7. Lorsque l'injection de toutes les souris est terminée, répétez l'étape 3.3 en utilisant le montant restant de l'inoculum pour déterminer la concentration post-injection de l'inoculum Listeria.
8. Le montant de l'injection de Listeria dans des souris est signalé comme l'UFC moyenne déterminée par les pré-et post-injection des échantillons d'inoculum Listeria.

Conseils & notes:

• Nous généralement injecter 500 - 3000 UFC (200 uL de 2.500 UFC / ml - 15 000 UFC / mL d'inoculum) en comparant la charge bactérienne et les réponses immunitaires entre une souche de souris résistantes (par exemple, C57BL / 6) et une souche de souris sensibles (p. ex BALB / c ).
• Si le stock infectieuses sera diluée dans le PBS par au moins 10 ^5, puis une étape de lavage est généralement pas nécessaire d'enlever les médias résiduelles / glycérol. Si le stock infectieuses ne sera pas diluée dans le PBS par au moins 10 ^5, puis une étape de lavage doit être ajouté à l'étape 3.2 pour enlever les médias résiduelles / glycérol comme suit: Ajj 9 ml de PBS à des stocks et des bactéries infectieuses décongelés recueillies par centrifugation à 2100 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire bactérienne dans 10 ml de PBS stérile, centrifugation répétition, et remettre en suspension les cellules bactériennes culot dans le volume souhaité. Déterminer la moyenne de l'UFC pré-et post-injection des échantillons d'inoculum Listeria comme décrit dans l'étape 3.3 et 3.7. Il est à noter que cette étape de lavage peut entraîner une certaine perte de bactéries, et il est recommandé que cette perte sera déterminé à l'avance et comptabilisés dans la prise de l'inoculum de la concentration requise.
• Jetez la seringue et l'aiguille après l'injection de la souris avec la bactérie Listeria.

4. Retrait de foie et la rate de souris infectées par Listeria pour l'analyse

1. Euthanase la souris infectées au point de temps souhaité après l'infection en utilisant une méthode approuvée par le Comité d'éthique animale locale, comme le CO ₂ asphyxie.
2. Effectuer saignent cardiaque immédiatement après l'euthanasie en utilisant une seringue de 1 mL et une aiguille de calibre 25. Recueillir le sang autant que possible. Retirer de la vésicule biliaire et de rompre la veine cave inférieure.
3. Exposer la veine porte hépatique en prenant soin pousser les intestins vers la droite, retournez le lobes du foie vers la tête et à la gauche de sorte que le foie est assis là où le diaphragme est situé. La veine porte hépatique se nourrit dans le fond du foie du côté inférieur droit.
4. Perfuser le foie en injectant 10 ml de PBS dans la veine porte hépatique avec une aiguille de calibre 26. PBS injecté par la veine porte se sortir de la veine cave inférieure rompu. Perfusion du foie assure que les cellules sont récoltées par le foie et non le sang circulant.
5. Retirer le foie perfusé de la cavité du corps de la souris, placer dans un tampon de FACS, et de stocker sur la glace. Passez à l'étape 5.1 pour la préparation du foie pour analyse FACS.
6. Retirez la rate de la souris, placez dans un tampon de FACS, et de stocker sur la glace.
7. Peser la rate entier, coupé en deux, et pèsent l'une des moitiés. Placez une moitié dans le tampon FACS et passez à l'étape 6.1. Placez l'autre moitié dans un sac Stomacher sur la glace et passez à l'étape 7.1.

Conseils & notes:

• Dans les étapes 4.5 et 4.6, l'utilisation suffisante de tampon FACS pour submerger entièrement le tissu pour minimiser l'exposition d'une partie du tissu à l'air.
• Une aiguille de ½ pouce de calibre 26 de longueur qui est courbé par ~ 30 degrés permet de mieux faciliter l'injection de PBS dans la veine porte hépatique.
• Lorsque perfusé correctement, le foie transforme d'une couleur rouge foncé à brun clair après l'injection de 1-2 ml de PBS.
• Si le foie n'est pas nécessaire pour l'analyse FACS, la perfusion n'est pas nécessaire. Le foie peut être isolé et recueilli directement dans un sac Stomacher et traitées comme décrit dans l'étape 7.
• Pour l'euthanasie des souris, le CO ₂ asphyxie est la méthode préférée parce qu'elle a un impact minimal sur UFC bactérienne et la viabilité des cellules immunitaires dans la rate et le foie. Si la collecte de sang n'est pas requise, luxation cervicale peut être utilisé comme méthode d'euthanasie alternative. Il est recommandé que les méthodes d'euthanasie qui peuvent affecter le poids des organes ou la viabilité des cellules immunitaires pas être utilisé (par exemple thiobarbituriques).

5. Préparation de la suspension de cellules hépatiques pour l'analyse de FACS

1. Générer une seule cellule suspensions en plaçant foie avec tampon FACS (étape 4.5) dans une passoire 70 um cellule qui est à l'intérieur d'un plat de Pétri de 60 mm. Poussez le tissu à travers le tamis de cellules en utilisant le piston de la seringue de 5 ml jusqu'à obtenir une suspension mono-cellule est formée.
2. Transférer les cellules hépatiques seule la suspension de la boîte de Pétri d'une conique de 50 ml à bouchon à vis tube et porter le volume total à 40 ml avec tampon FACS froid.
3. Suspension cellulaire Vortex et de prendre une aliquote de 1 ml pour déterminer la charge bactérienne pour le foie. Passez à l'étape 7.3 et d'utiliser cette aliquote de 1 ml à la place de homogénat de tissu dans un sac Stomacher.
4. Cellules par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant, resuspendre le culot dans 40 ml de tampon FACS froid, un culot cellulaire par centrifugation à 500 g pendant 5 min à 4 ° C, et éliminer le surnageant.
5. Reprendre le culot cellulaire dans 20 ml de Percoll isotonique à température ambiante. Centrifuger la suspension cellulaire à 700 xg pendant 12 min à température ambiante. Jeter le surnageant et feuilles en forme de disque de cellules flottant sur le dessus (hépatocytes par exemple). Reprendre le culot de leucocytes contenant dans 4 ml de tampon TAC pour lyser les érythrocytes et les cellules incuber à température ambiante pendant 10 min avec une inversion fréquente.
6. Suspension cellulaire Filtrer à travers une membrane de nylon 100 um dans un nouveau tube de 10 ml centrifugeuse.
7. Sous-couche filtrée suspension cellulaire avec 1 ml de FCS / EDTA. Centrifuger à 350 xg pendant5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 5 ml FACS / EDTA.
8. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 xg pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 0,5 à 3 ml FACS / EDTA selon la taille de la pastille.
9. Diluer 1:05-1:20 suspension cellulaire dans le bleu trypan selon le volume de suspension à l'étape 5.8. Comptez leucocytes hépatiques viables utilisant hématimètre (figure 4A) et déterminer le total de cellules viables comme suit: des cellules viables / orgue = nombre de cellules dans le facteur de dilution x surface comptant x 10 ⁴ x volume (ml). Foie unicellulaires suspensions peuvent alors être marquées avec des anticorps spécifiques pour désirée marqueurs de surface cellulaire et analysées par FACS.

Conseils & notes:

• Gardez les cellules sur la glace, sauf indication contraire.

6. Préparation de la rate une seule cellule de suspension pour analyse FACS

1. Générer une seule cellule suspensions en plaçant une moitié de la rate (étape 4.7) avec le tampon FACS dans une passoire 70 um cellule qui est à l'intérieur d'un plat de Pétri de 60 mm. Poussez doucement le tissu à travers le tamis de cellules en utilisant le piston de la seringue de 5 ml jusqu'à obtenir une suspension mono-cellule est formée.
2. Transfert de la rate une seule cellule de suspension de la boîte de Pétri d'un tube à centrifuger de 10 ml et porter le volume total à 10 ml par le froid tampon FACS.
3. Cellules par centrifugation à 350 xg pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 4 ml de tampon TAC pour lyser les érythrocytes et les cellules incuber à température ambiante pendant 10 min avec une inversion fréquente.
4. Suspension cellulaire Filtrer à travers une membrane de nylon 100 um dans un nouveau tube de 10 ml centrifugeuse.
5. Sous-couche filtrée suspension cellulaire avec 1 ml de FCS / EDTA. Centrifuger à 350 xg pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 5 ml FACS / EDTA.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 xg pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire en 3-8 ml FACS / EDTA selon la taille de la pastille.
7. Diluer la suspension cellulaire 1:10 - 1:20 dans le bleu trypan (0,4% dans l'eau distillée), selon le volume de suspension à l'étape 7.6. Comptez splénocytes viables utilisant hématimètre - voir l'étape 5.9 pour le calcul total des cellules viables par l'organe rate une seule cellule suspensions peuvent alors être marquées avec des anticorps spécifiques pour désirée marqueurs de surface cellulaire et analysées par FACS.

Conseils & notes:

1. Gardez les cellules sur la glace, sauf indication contraire.

7. Mesure de la charge bactérienne dans les tissus de souris infectées par Listeria

1. Pliez le haut du sac contenant la moitié Stomacher rate. Tout en tenant le sac Stomacher fermées pour éviter les fuites, le poser à plat sur un banc propre ou dans une hotte à flux laminaire. Rouler un stylo épais rondes sur les tissus jusqu'à ce que le tissu est écrasée dans le sac.
2. Ajouter 5 ml de PBS dans chaque sac contenant des tissus Stomacher purée. Placez le sac Stomacher dans le Stomacher, et exécutez le Stomacher à vitesse élevée pendant 10 minutes.
3. Mélanger l'homogénat dans le sac Stomacher (ou l'aliquote de 1 ml de suspension cellulaire hépatique) avec une pipette. Procédez comme suit dans les doublons. Transfert 300 ul d'une plaque 96 puits à fond plat. Dans le puits de la plaque de 96 puits effectuer des dilutions 1:10 (30 uL dans 270 ul de PBS) à une dilution 10 ^-5 pour chaque échantillon de tissu homogénat.
4. Étaler soigneusement 0,1 ml de chaque dilution sur une plaque pré-séché HBA à l'aide d'un épandeur de verre. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
5. Comptez le nombre d'UFC pour chaque dilution et calculer les UFC par des tissus en tenant compte de la portion du tissu (par exemple une demi-rate), facteur de dilution, et le volume total de l'homogénat de tissu (5 ml ou 40 ml): UFC / tissus = facteur de dilution CFU/0.1 ml x x mL / tissus, car la rate diviser ce nombre par le pourcentage en poids de l'échantillon utilisé pour l'homogénéisation rate tissu (voir étape 4.7).

Conseils et remarques:

• Plus d'un sac Stomacher peut être placé dans le Stomacher à un moment aussi longtemps que le volume total ne dépasse pas le volume maximum tel que spécifié par le fabricant
• Si un Stomacher n'est pas disponible, une homogénéisation des tissus peuvent être utilisés à la place. Alternativement, la méthode suivante, bien que pas aussi efficace, peut également être utilisé manuellement macérer les organes mis en place des étapes 7.1 et 7.2: organe placer dans un sac plastique scellé stérilisés et couché sur un banc propre tout en tenant le sac fermé pour empêcher la fuite . Rouler une bouteille de 500 ml en verre de laboratoire de façon répétitive sur le sac jusqu'à ce que le tissu soit bien en purée. Ajouter 5 ml de PBS dans chaque sac et passer à l'étape 7.3.
• Il est très important dans l'étape 7.4 que les plaques HBA être séché à fond(Ie pas de l'humidité sur la gélose). Sinon, il peut être difficile d'obtenir des colonies de Listeria distincts qui peuvent être comptés correctement.
• Si il ya peu de plaques HBA, une autre étape 7.4 est la suivante: dessiner des lignes sur le fond d'une plaque de pré-séché HBA (étape 1.1) de la diviser en cinq à six sections, une pour chaque dilution. Soigneusement pipette de 25 ul de chaque dilution en sections correspondant sur la plaque HBA pour chaque homogénat de tissu - ne se propagent pas avec un épandeur. Attendez jusqu'à ce que des gouttes d'homogénat de tissus sont secs avant inversant la plaque. Incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit. Jusqu'à 80 colonies peuvent être distingués en raison de une goutte sur une plaque de gélose.
• Dilution de homogénats de tissu peut dépendre de la croissance de Listeria dans l'animal et peut être estimée sur la base des symptômes affichés par l'animal au moment de l'euthanasie. Pour les souris qui sont sensiblement moribonde, puis des dilutions supplémentaires peuvent être nécessaires pour déterminer plus précisément la charge bactérienne. Pour les souris inoculées avec de faibles doses de Listeria ou souris euthanasiés à la fin de la période d'infection, homogénat tissulaire non diluée peut être utilisée pour déterminer la charge bactérienne.
• Les plaques peuvent être incubées à 37 ° C pendant la nuit ou à température ambiante pendant 2-3 jours.

8. Les résultats représentatifs:

Pour une expérience d'infection standard, Listeria a été obtenue à partir d'un stock de glycérol congelés et striée sur une plaque HBA comme le montre la figure 1. Si quelques colonies sont obtenues après étalement, cela peut indiquer une strie pauvres ou moins de stock congelé optimale. Un stock de Listeria infectieuses a été préparé à partir d'une plaque striée fraîchement HBA et conservés à -70 ° C. Pour la mesure de la clairance bactérienne et les réponses immunitaires, nous avons l'habitude de diluer la dégelée de stock Listeria infectieuses à 2.500 UFC / ml - 15 000 UFC / ml et injecter des souris avec 200 uL de les infecter avec 500 - 3000 UFC. Nous observons que les souris infectées par des doses sub-létales de Listeria en utilisant ce protocole peut transitoirement présentent fourrure ébouriffée, une posture voûtée et la perte de poids au sein des premiers jours. Ces symptômes de fournir un repère visuel quant à la façon d'une souris sévèrement individu est affecté par l'infection, si elle réagit différemment au reste du groupe (c'est à dire une "évidente" aberrantes), et si l'euthanasie est nécessaire pour éviter des souffrances excessives et de la mort imminente due à l'infection.

Dans les résultats représentés par les figures 2-5, souris ont été infectées en utilisant une partie aliquote fraîchement dégelé de stock infectieuses Listeria. A différents moments après l'infection, les souris ont été euthanasiés et le foie et la rate ont été enlevés. La figure 2 montre une plaque sur laquelle HBA homogénat dilué de la rate une seule souris a été cultivé. Il devrait y avoir une nette diminution du nombre de colonies que le facteur de dilution devient plus élevé, telles que le comptage des CFU distinctes est possible pour au moins deux dilutions. Si la souris a autorisé l'infection à Listeria (limite de détection ie = 100 UFC / tissu), puis <5 colonies de Listeria seront présents sur la plaque de HBA qui a été étendue avec 200 uL d'homogénat tissulaire non dilué. Si le foie et / ou de la rate être contaminés par des bactéries intestinales ou d'autres externes lors de l'isolement, les colonies sur la plaque de HBA sont susceptibles de présenter morphologie différente (c'est à dire ne pas avoir halo caractéristique et la couleur pâle de colonies de Listeria) et / ou peut être différents du nombre de colonies de ce qui est prévu pour Listeria (trop peu ou trop). La figure 3 montre une courbe typique de la clairance de Listeria pour les souris C57BL / 6 - à noter que la Listeria sont généralement un dédouanement plus rapide de la rate que le foie et que le franchissement n'est pas le cas jusqu'à cinq jours après l'infection.

La figure 4 montre numérations cellulaires basés sur une seule cellule suspensions préparées à partir de la rate et le foie de souris infectées à différents moments après l'infection. Cette méthode peut atteindre pureté> 95% des leucocytes dans une seule cellule suspensions préparées à partir de foie et> 80% de la rate. La pureté des leucocytes peut être déterminé par analyse FACS en utilisant un anticorps monoclonal spécifique pour le marqueur pan-leucocytaire CD45 (clone 30-F11). Typiquement, le nombre de splénocytes et les leucocytes hépatiques augmentent pendant la période nécessaire pour effacer l'infection par le foie présentant une plus grande augmentation d'un facteur dans les leucocytes hépatiques, mais un total nettement plus petite, comparée à l'augmentation des splénocytes dans la rate. Le type et le nombre de cellules immunitaires peuvent être déterminés par l'étiquetage des suspensions unicellulaires avec des anticorps spécifiques pour les marqueurs de surface cellulaire. Les cellules marquées peuvent alors être détectées par analyse FACS. La figure 5 donne des résultats représentatifs pour les lymphocytes T CD8 ^+. Lors d'une infection norme Listeria dans les souris C57BL / 6, le nombre de cellules T CD8 ⁺ diminue transitoirement en raison d'une lymphopénie dans la rate à jours 2-3 before plus en plus nettement à partir de 5 jours post-infection dans les deux de la rate et le foie.

Figure 1. Plaque HBA striée de Listeria. Une boucle d'inoculation stérile a été utilisé pour strier la Listeria à partir d'un stock de glycérol congelés. La plaque a été incubée à 37 ° C pendant la nuit. Le halo caractéristique entourant les colonies individuelles est due à β-hémolyse.

Figure 2. Tissue homogénat d'une souris infectée par Listeria cultivées sur des plaques HBA. Un foie a été prélevé à partir d'un C57BL Listeria infectés / 6 souris à 3 jours post-infection. Homogénat de tissu a été préparé et placé dilutions de 100 ul assiette pleine diffusion de dilution de 10 ^-4 (A) et 10 ^-5 dilution (B), ainsi que 25 gouttes ul sur une plaque HBA pour chaque dilution 1:10 de pur à 10 ^-5 (C). Les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant la nuit. Les dilutions qui permettent le comptage des colonies individuelles sont utilisées pour déterminer la charge bactérienne (c. UFC / tissu) à ce point de temps après l'infection.

Figure 3. Charge de Listeria dans la rate et le foie des souris C57BL / 6 infectées à 3 et 7 jours post-infection. Des souris C57BL / 6 ont été infectées avec ~ 2000 UFC de Listeria. A chaque point du temps, les souris ont été euthanasiés, le foie a été perfusé et récolté avec la rate, et les dilutions de l'homogénat spléniques (A) ou hépatique unique de cellules en suspension (B) ont été cultivées sur des plaques HBA pour déterminer la charge bactérienne. Les lignes pleines indiquent une moyenne géométrique, et les barres verticales indiquent SEM. La ligne pointillée indique que la limite de détection pour la mesure précise de la charge bactérienne est de 100 UFC / orgue pour cette expérience.

Figure 4. Numération des cellules viables pour les tissus de souris infectées. Des souris C57BL / 6 ont été infectées avec ~ 2000 UFC de Listeria. A chaque point du temps, les souris ont été euthanasiés, le foie perfusé et récolté avec la rate. Les cellules ont été colorées au bleu trypan et comptées en utilisant un hématimètre comme décrit dans l'étape 5.9 (A). Leucocytes splénocytes (B) et hépatique (C) obtenu à partir de comptes à cellule unique suspensions préparées à partir de souris infectées par Listeria. Les lignes indiquent la moyenne géométrique.

Figure 5. Analyse FACS des cellules T CD8 ⁺ dans les souris infectées par Listeria. Des souris C57BL / 6 ont été infectées avec ~ 2000 UFC de Listeria. A chaque point du temps, les souris ont été euthanasiés, le foie perfusé et récolté avec la rate. Une seule cellule suspensions ont été colorées avec des anticorps spécifiques des cellules T (CD3, TCRβ, CD4, CD8). (A) représentant des profils FACS avec% des cellules T CD8 ⁺ + / - SEM. (B) Total des cellules CD8 ⁺ T dans la rate. (C) Total des cellules CD8 ⁺ T dans le foie.

Discussion

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Cheval gélose au sang de base n ° 2	Oxoid	CM0271	Préparation de la gélose de base pour les plaques HBA
Le sang de cheval (défibriné)	Oxoid	HB1000	Ajouter 5-10% à la base d'agar
Brain Heart Infusion (BHI) (10 ml)	Oxoid	TM456
Les médias du cerveau coeur perfusion déshydratée	Oxoid	CM1135
Plaque de 96 puits à fond plat	BD Biosciences	353072
70 tamis cellulaire um	BD Biosciences	352350
Petite boîte de Pétri	BD Biosciences	351007
Stomacher 80 Biomaster laboratoire de système de	Seward
Sacs en plastique Stomacher	Sarstedt	86 9924 530
L'albumine sérique bovine	Sigma	A3912
Tampon FACS			0,1% (p / v) de sérum albumine bovine dans du PBS
Isotonique Percoll (33,75 Percoll% dans PBS)	GE Healthcare	17-0891-01	33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, PBS 1x 62.5mL fait 100mL isotonique Percoll
TAC Tampon			Tris 17mm, 140mm de chlorure d'ammonium dans l'eau distillée
FCS / EDTA			Sérum de veau fœtal à 10mm EDTA
FACS / EDTA			FACS tampon + EDTA 5mM
Le bleu trypan	Sigma	T6146	0,4% (p / v) dans du PBS, stérilisée par filtration
2mL Cryovial	Greiner Bio One	121263
27 seringue à insuline gauge/1mL	Terumo Medical Products	SS10M2713
L'aiguille	Terumo Medical Products	NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Seringue	Terumo Medical Products	SS-01T (1ml), SS-053 (5 ml), le SS-10S (10 ml)