Измерение бактериальной нагрузки и иммунного ответа в мышей, инфицированных Listeria моноцитогенес</em

Резюме

Listeria моноцитогенес является модельного организма для изучения иммунные реакции и генетической предрасположенности к внутриклеточных бактерий у мышей. Этот метод позволяет измерять бактериальной нагрузки и генерировать одноклеточных суспензий печени и селезенки от мышей для FACS анализ для определения изменений в иммунных клетках в связи с Listeria инфекции.

Аннотация

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen¹. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection². After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8α⁺ dendritic cells and Kupffer cells^3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells⁵. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8⁺ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection⁶.

Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses⁶ . There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains^7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection^6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.

We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain¹⁵ that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to β-hemolysis¹ (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

протокол

1. Культивирование и долгосрочного хранения Listeria моноцитогенес (Listeria)

1. Сделать или купить готовые лошади кровяной агар (HBA) пластин. Сухие пластины до использования заранее инкубации при температуре 37 ° С в течение ночи или размещение обнаружены в кабинете ламинарного потока в течение 1 часа.
2. Получить жизнеспособной Listeria от одного из следующих действий: инфицированные гомогената ткани мыши, лиофилизированный акций, замороженные запасы глицерина, или колонию из последних Listeria культуры (т.е. менее одной недели старые и не под-культурный более 10 поколений) . Все Listeria должны быть получены с помощью стерильного посева петлю и использованием асептических методов для всех методов, описанных в данном протоколе.
3. Подряд Listeria на тарелку HBA как показано на рисунке 1, используя стерильные прививки цикла: полоса Listeria более ¼ поверхности пластины в качестве основного распространения инокулята. Сделать серии однонаправленных полос от первичного распространения. Повторите 2-3 раза полос использованием свежих или повторно стерилизовать цикла перед каждым набором полосы. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи.
4. Магазин Listeria пластины HBA при 4 ° С в течение максимального периода в 1 месяц или переходите к шагу 1,5 подготовить Listeria культуры для долгосрочного хранения.
5. Выберите одну колонию из свежих Listeria культуры на пластине HBA использованием стерилизованных посева петлю и привить 10 мл сердечно-мозговой инфузии (BHI) бульон (подготовить в соответствии с инструкциями производителя) в 30 мл бутылка Маккартни.
6. Инкубируйте Listeria культуры в орбитальной шейкере при 180rpm при температуре 37 ° С в течение ночи.
7. Добавить стерильный 80% глицерина (об / об) в жидкое Listeria культуры в соотношении 1:1 для получения конечной концентрации глицерина на 40% (об. / об). Передача 0,5-1 мл аликвот в криопробирки и хранить Listeria / глицерина запасов при -70 ° C.

Советы и замечания:

• Рост Listeria может поддерживаться на разных неселективным носители, такие как диапазон кровяной агар (дополнено лошадь, овца, морская свинка или кровь человека), сердечно-мозговой инфузии (BHI), агар или бульон, или триптического бульоном соевый с дрожжами экстракт (TSB-YE). Заражение рост может быть сведено к минимуму в культуре, добавив антибиотики для средств массовой информации для штаммов Listeria с определенной устойчивости к антибиотикам (например, Л. моноцитогенес 10403S), или с помощью Оксфорд средства массовой информации, которые избирательно поддерживать рост Listeria.
• Если Listeria получена из непроверенных источников, рекомендуется проведение дополнительных испытаний проводится для подтверждения личности Listeria (L. моноцитогенес является грамположительных, не спорообразующих, подвижных в <30 ° C, факультативно анаэробные, каталаза положительным, и оксидазы отрицательный). Получены культуры также может быть выращена на Listeria селективных средах, чтобы чистая культура получается.
• Сушка HBA пластин гарантирует, что существует оптимальное разделение бактериальных колоний на пластину.
• При принятии замороженные запасы глицерина Listeria, используйте свежий HBA Listeria культур, которые составляют менее 1 неделя и суб-культивировали в течение нескольких поколений, как это возможно (<5 лучше).
• При выводе свежие Listeria культур из замороженных фондовом глицерин, первый проход должен быть сделан на твердой среде (то есть HBA пластин), так как Listeria полученных из замороженных запасов глицерина растут плохо, когда непосредственно пересевают в жидкой среде.

2. Приготовление и хранение Listeria инфекционных акции для прижизненного исследования инфекции

1. Подряд Listeria от замороженных фондовом глицерина (шаг 1,7) на тарелку HBA, как описано в пункте 1.3. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи для использования на следующий день.
2. Выберите одну из колонии Listeria полоса культуры и привить 10 мл BHI бульона. Избегайте передачи агар в бульон.
3. Инкубируйте Listeria культуры BHI в орбитальном шейкере при 180 оборотах в минуту и 37 ° С до середины логарифмической фазы (OD600 = ~ 0,4). Это обычно занимает 3-4 часа.
4. Возьмите 0,9 мл аликвоту асептически и получить чтения ОП при 600 нм в 3-4 часов тряски. Если OD чтение <0,3, то продолжать культуры в орбитальном шейкере при 180 оборотах в минуту и ​​37 ° С до чтения ОП составляет ~ 0,4.
5. Добавьте 1 мл стерильного 80% глицерина (объем / объем) до 10 мл культуры листерий BHI бульона (OD600 ~ 0,4). Осторожно перемешать и передачи в пробирки на 1,5 мл микроцентрифужную в 0,5-1 аликвоты мл.
6. Место аликвот на льду в течение 10 мин и хранят при температуре -70 ° C. Оставьте одну аликвоту разморожены, чтобы определить концентрацию Listeria в инфекционное акции, которые, как правило, в порядке 10 ⁹ КОЕ / мл.
7. Выполните 1:10 серийные разведения unfroдзен Listeria инфекционных акций PBS до 10 ^-8 разбавления. Спред 100 мкл неразбавленного и каждого последующего разведения на предварительно высушенного пластин HBA (шаг 1.1) в двух экземплярах с помощью стеклянной спредера. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи.
8. Подсчитайте количество колоний на каждой пластине и определяют концентрацию Listeria замороженных инфекционных культуры материала по следующей формуле: концентрация (КОЕ / мл) = количество колоний х коэффициент разбавления / 0,1 мл. Пластины выбрана для подсчета в идеале должна иметь 30-300 колоний для обеспечения надежной оценки концентрации КОЕ жизнеспособных бактерий.
9. Через несколько дней после хранения Listeria инфекционных акции при -70 ° C, оттепель одну трубу. Определить концентрацию жизнеспособных Listeria как описано в пунктах 2.7 и 2.8. Эта концентрация должна быть такой же, определяется для свежеприготовленной инфекционных акции в шаге 2.8.

Советы и замечания:

• Listeria инфекционных запас замороженных на более низкий процент глицерина (8%), чем для Listeria замороженные для общего долгосрочного хранения (40%).
• Замороженные Listeria инфекционных запасов, как правило, стабильны при -70 ° C до 3 месяцев. При использовании более 3 месяцев, рекомендуется, чтобы новые инфекционные фондовом быть приготовлены из свежих Listeria культуры на пластине HBA.
• Если концентрация талой Listeria инфекционных акций (шаг 2.9) отличается от свежеприготовленной фондовом как описано в пунктах 2.7 и 2.8 (т.е.> 20% снижение КОЕ), то новый замороженный инфекционных акции должны быть подготовлены.
• Хотя первоначально больше времени, чем подготовка свежих бактериальных инокулята для одного эксперимента, подготовка замороженных Listeria инфекционных запасов обеспечивает точное определение концентрации КОЕ до инфекции и лучшего соответствия между экспериментов, когда мышей инфицированы из того же замороженных запасов.

3. Подготовка Listeria посевной и внутривенные инъекции мышей

1. Определить концентрацию Listeria, который будет введен на мышь. Для внутривенных инъекций, КОЕ в 200 мкл посевного на мышь не используется.
2. Оттепель из замороженных аликвоту Listeria инфекционных акций (из шага 2.6). Развести инфекционных акций PBS к желаемой Listeria концентрации КОЕ. Двойной объем необходимых для потребителей инъекционных все мыши, чтобы гарантировать, что есть достаточно посевной для инъекций и определение Listeria КОЕ до и после инъекции (шаг 3.3 и 3.7).
3. Удалить 2x 0,1 мл аликвоты из подготовленных Listeria посевной, а также подготовить 1:10 разведением в PBS для каждой аликвоты перед инъекцией мышам. Пластины 0,1 мл каждого разведения на пластинах HBA, и инкубировать пластин ночи при 37 ° C. Подсчитайте количество колоний и определить предварительного впрыска концентрацию Listeria посевной: концентрация (КОЕ / мл) = (число колоний х коэффициент разбавления) / мл покрытием для этого фактор разведения.
4. Передача мыши, который будет введен в чистую клетку. Теплые мышь, разместив клетку ~ 50 см при 250 Вт инфракрасной лампой в течение 5 мин (другого подходящего теплового устройства, которые не будут гореть мыши или повышения температуры клетку выше 40 ° С также может быть использован). Наведите в сдерживающих устройств для инъекций хвостовую вену.
5. Аккуратно перемешайте Listeria подвески для поддержания последовательного подвеску каждый раз шприц загружается.
6. Найдите боковое вены хвоста мыши, аккуратно протрите 70% этанола вытереть и вводят 200 мкл Listeria посевной (в нужной концентрации), используя шприц с иглой 27. Кратко оказать давление на вступление рану стерильную марлю. Вернуться мыши к его клетке.
7. При введении мышам все завершится, повторите шаг 3,3, используя оставшиеся количество посевного, чтобы определить после инъекции концентрация Listeria посевной.
8. Количество Listeria вводили мышам сообщается как средняя КОЕ определяется из пред-и после инъекции Listeria образцов посевной.

Советы и замечания:

• Мы обычно вводят 500 - 3000 КОЕ (200 мкл 2500 КОЕ / мл - 15 000 КОЕ / мл посевной материал) при сравнении бактериальной нагрузки и иммунные реакции между устойчивый штамм мыши (например, C57BL / 6) и восприимчивым штаммом мыши (например, BALB / с ).
• Если инфекционные акции будут разводят в PBS, по крайней мере 10 ^5, то промывки обычно не требуется, чтобы удалить остатки средств массовой информации / глицерин. Если инфекционные акции не будет разбавляться в ФБР, по крайней мере 10 ^5, то мытье шаг должен быть добавлен в п. 3.2 для удаления остатков средств массовой информации / глицерина следующим образом:дд 9 мл PBS, чтобы талые инфекционных акций и бактерий, собранных с помощью центрифугирования при 2100 мкг в течение 10 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и ресуспендируйте гранулированных бактериальных клеток в 10 мл стерильной PBS, повторите центрифугирования и ресуспендирования бактериальный осадок клеток в нужном объеме. Определить средний КОЕ из пред-и после инъекции Listeria образцов посевной, как описано в шаге 3.3 и 3.7. Следует отметить, что этот шаг может стиральной привести к некоторой потере бактерий, и рекомендуется, что такая утрата быть определена заранее и составили в принятии посевной необходимой концентрации.
• Безопасное отказаться от шприца и иглы после инъекции мыши с Listeria.

4. Удаление печени и селезенки с Listeria-инфицированных мышей для анализа

1. Euthanase инфицированные мыши на нужной временной точке после инфекции, используя метод, утвержденных местными животными Комитет по этике, таких, как CO _2, удушье.
2. Выполните сердечной кровотечение сразу после эвтаназии использованием шприца 1 мл и 25 иглы. Собрать много крови, как это возможно. Удаление желчного пузыря и разорвать нижнюю полую вену.
3. Expose печеночной воротной вены, аккуратно нажав кишечника право, флип печени долях к голове и влево так печени сидит где диафрагма находится. Печеночной воротной вены каналов в нижней части печени от нижней правой стороне.
4. Заливать печени путем введения 10 мл PBS в печеночной воротной вены использованием 26 иглы. PBS вводят через портальную вену выйдет из разорвал нижнюю полую вену. Печень перфузии гарантирует, что собрано клетки из печени и не циркулирующей крови.
5. Удалить перфузии печени из организма мыши полости, поместить в буфер FACS, и хранить на льду. Перейдите к пункту 5.1 для подготовки печени для анализа FACS.
6. Удаление селезенки от мышей, поместить в буфер FACS, и хранить на льду.
7. Взвесьте все селезенки, разрезать пополам, и весить одна из половинок. Положите одну половину в буфер FACS и перейдите к пункту 6.1. Место другая половина в сумке корсаж на льду и переходите к шагу 7.1.

Советы и замечания:

• В шагах 4.5 и 4.6, использование достаточного буфера FACS, чтобы полностью погрузиться тканей для минимизации воздействия какой-либо части ткани с воздухом.
• ½ дюйма длиной 26 иглы, стремящейся на ~ 30 градусов может лучше способствовать введение PBS в воротной вены печени.
• При перфузии должным образом, печень превращается из темно-красного цвета до светло-коричневого после введения 1-2 мл PBS.
• Если печень не требуется для анализа FACS, перфузия не является необходимым. Печени могут быть выделены и собираются непосредственно в сумку корсаж и обрабатывается, как описано в шаге 7.
• За эвтаназию мышей, CO ₂ удушья является предпочтительным методом, поскольку она оказывает минимальное воздействие на бактериальную КОЕ и иммунной жизнеспособности клеток в селезенке и печени. Если сбор крови не требуется, шейки дислокации могут быть использованы в качестве альтернативного метода эвтаназии. Рекомендуется, что эвтаназия методы, которые могут повлиять на вес органа или иммунной жизнеспособность клеток не может использоваться (например, thiobarbiturates).

5. Подготовка печени клеточной суспензии для анализа FACS

1. Создание одноклеточных суспензий путем размещения печени с FACS буфера (шаг 4.5) в ячейки 70 мкм фильтр, который находится внутри 60 мм чашки Петри. Нажмите ткани через ячейки сетчатого фильтра, используя поршень из шприца 5 мл до одной клеточной суспензии образуется.
2. Передача печеночной одноклеточных отстранение от чашки Петри с 50 мл конической винтовой колпачок трубки и довести общий объем до 40 мл холодной буфера FACS.
3. Vortex суспензии клеток и взять 1 мл аликвоту определить бактериальную нагрузку для печени. Перейдите к пункту 7.3 и использовать это 1 мл аликвоту вместо гомогената ткани в сумке корсаж.
4. Гранул клетки центрифугированием при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, отказаться от супернатанта, ресуспендируют осадок в 40 мл холодного буфера FACS, пеллет клетки центрифугированием при 500 мкг на 5 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант.
5. Ресуспендируют осадок клеток в 20 мл изотонического Перколла при комнатной температуре. Центрифуга клеточной суспензии при 700 мкг в течение 12 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и дискообразных лист клетки плавающим на поверхности (например, гепатоциты). Ресуспендируют лейкоцитов содержащих гранулы в 4 мл буфера TAC лизировать эритроциты и клетки инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин с частыми инверсии.
6. Фильтры суспензии клеток через 100 мкм нейлоновую мембрану в новый 10 трубки центрифуги мл.
7. Подложка фильтруется клеточной суспензии с 1 мл ФТС / ЭДТА буфере. Центрифуга при 350 мкг для5 мин при 4 ° С, отбросить супернатант, и ресуспендируют в 5 мл FACS / ЭДТА буфере.
8. Центрифуга клеточной суспензии при 350 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 0,5-3 мл FACS / ЭДТА буфера в зависимости от размера гранул.
9. Развести клеточной суспензии 1:5-1:20 в трипанового синего в зависимости от объема подвески в шаге 5.8. Граф жизнеспособных лейкоцитов печеночной использованием hemacytometer (рис. 4а) и определить общую жизнеспособных клеток следующим образом: жизнеспособных клеток / органа = количество ячеек в области подсчета фактор разведения х х 10 ⁴ х объем (мл). Печень одноклеточных суспензий могут быть помечены антитела, специфичные к желаемой поверхности клеток маркеры и проанализированы СУИМ.

Советы и замечания:

• Держите клетки на льду, если не указано иное.

6. Подготовка селезенки одной клеточной суспензии для анализа FACS

1. Создание одноклеточных суспензий путем размещения половины селезенки (шаг 4.7) с буфера FACS в ячейки 70 мкм фильтр, который находится внутри 60 мм блюдо Петри. Аккуратно нажмите ткани через ячейки сетчатого фильтра, используя поршень из шприца 5 мл до одной клеточной суспензии образуется.
2. Передача селезенки одноклеточных отстранение от чашки Петри с 10 мл центрифужную пробирку и довести общий объем до 10 мл с использованием холодного буфера FACS.
3. Гранул клетки центрифугированием при 350 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, отказаться от супернатанта, ресуспендируют осадок клеток в 4 мл буфера TAC лизировать эритроциты, клетки и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин с частыми инверсии.
4. Фильтры суспензии клеток через 100 мкм нейлоновую мембрану в новый 10 трубки центрифуги мл.
5. Подложка фильтруется клеточной суспензии с 1 мл ФТС / ЭДТА буфере. Центрифуга при 350 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 5 мл FACS / ЭДТА буфере.
6. Центрифуга клеточной суспензии при 350 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 3-8 мл FACS / ЭДТА буфера в зависимости от размера гранул.
7. Развести 1:10 клеточной суспензии - 1:20 в трипанового синего (0,4% в дистиллированной воде) в зависимости от объема подвески в шаге 7.6. Граф жизнеспособных спленоцитов использованием hemacytometer - см. Шаг 5,9 для расчета общего жизнеспособных клеток в органе Селезенка одноклеточных суспензий могут быть помечены антитела, специфичные к желаемой поверхности клеток маркеры и проанализированы СУИМ.

Советы и замечания:

1. Держите клетки на льду, если не указано иное.

7. Измерение бактериальной нагрузки в тканях с Listeria-инфицированных мышей

1. Сложите верхней части сумки корсаж содержащие селезенки наполовину. Удерживая мешок корсаж закрыты, чтобы предотвратить утечку, положите его плашмя на чистом столе или в шкафу ламинарного потока. Ролл толстых круглых перо тканей до тканей пюре в сумку.
2. Добавьте 5 мл PBS, чтобы каждый мешок корсаж содержащих пюре ткани. Место мешок корсаж в корсаж, и запустить корсаж на высокой скорости в течение 10 минут.
3. Смешайте гомогената в сумке корсаж (или 1 мл аликвоту печеночной суспензии клеток) с пипеткой. Выполните следующие в двух экземплярах. Передача 300 мкл до 96-и плоским дном тарелку. В скважинах 96-луночного планшета выполняют 1:10 серийных разведений (30 мкл в 270 мкл PBS) до 10 ^-5 для каждого разведения гомогената ткани образца.
4. Тщательно распространению 0,1 мл каждого разведения на предварительно высушенный HBA пластины с использованием стекла спредера. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи.
5. Подсчитайте количество КОЕ для каждого разбавления и рассчитывать КОЕ на ткани с учетом части ткани (например, половину селезенки), коэффициент разбавления, а общий объем гомогената ткани (5 мл или 40 мл): КОЕ / ткани = CFU/0.1 мл х коэффициент разбавления х мл / ткани; для селезенки разделить это число на процент веса селезенки образец ткани для гомогенизации (см. шаг 4.7).

Советы и примечания:

• Более одного корсаж сумка может быть помещена в корсаж на время, пока общий объем не превышает максимальный объем, как указано производителем
• Если корсаж отсутствует, ткани гомогенизатор может использоваться вместо этого. Кроме того, следующий метод, хотя и не столь эффективными, также может быть использован для ручного вымачивать орган в месте шагах 7.1 и 7.2: место органа в запечатанном стерилизовать полиэтиленовый пакет и лежали на чистом столе, удерживая сумку закрыть, чтобы предотвратить утечку . Ролл 500 мл лаборатории стеклянную бутылку повторно за пакет, пока ткань тщательно пюре. Добавьте 5 мл ФСБ в каждую сумку и перейдите к шагу 7.3.
• Это очень важный шаг в 7,4, что HBA пластин быть высушены тщательно(Т.е. без влаги на агар). В противном случае это может быть трудно получить различные Listeria колонии, которые могут быть подсчитаны правильно.
• Если Есть ограниченные пластинами HBA, альтернативный шаг 7.4 Рисование линий на нижней части предварительно высушенного HBA пластины (шаг 1.1), чтобы разделить его на 5:55 разделов, по одному для каждого разведения. Тщательно пипетки 25 мкл каждого разведения в соответствующих разделах на тарелке HBA для каждого гомогената ткани - не распространялся с спредера. Подождите, пока капли гомогената ткани сухие перед обращением пластины. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° С в течение ночи. До 80 колоний могут быть выделены из-за одной капли на агар пластины.
• Разбавление ткани гомогенатах может зависеть от Listeria роста животных и могут быть оценены на основе симптомов отображается животных во время эвтаназии. Для мышей, которые заметно умирающий, то дополнительные разведения могут быть необходимы для более точного определения бактериальной нагрузки. Для мышей, инокулированных низкие дозы Listeria или мышей euthanased в конце периода инфекции, неразбавленный гомогената ткани могут быть использованы для определения бактериальной нагрузки.
• Плиты можно инкубировать при 37 ° С в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2-3 дней.

8. Представитель Результаты:

Для стандартного эксперимента инфекции, Listeria была получена из замороженных фондовом глицерина и прожилками на тарелку HBA, как показано на рисунке 1. Если несколько колоний, полученных после полос, это может указывать на неудовлетворительное полос или менее оптимальное замороженных запасов. Listeria инфекционных акции получают из свежих прожилками плита HBA и хранится при температуре -70 ° C. Для измерения бактериальной очистки и иммунные реакции, мы обычно разбавить талой Listeria инфекционных акции до 2500 КОЕ / мл - 15 000 КОЕ / мл и вводят мышам с 200 мкл, чтобы заразить их 500 - 3000 КОЕ. Заметим, что мышей, инфицированных к югу от смертельных доз Listeria с помощью этого протокола может временно выставлять взъерошил мех, сгорбленная осанка и потеря веса в течение первых нескольких дней. Эти признаки обеспечивают визуальный сигнал о том, как сильно человек мыши зависит от инфекции, будь-разному реагирует на остальных членов группы (то есть "очевидные" выброс), и будет ли эвтаназия необходима для предотвращения чрезмерного страдания и приближающейся смерти из-за инфекции.

В результаты представлены на рисунках 2-5, мышей были инфицированы использованием свежей талой аликвоту Listeria инфекционных акций. В разные моменты времени после заражения, мышей euthanased и печени и селезенки были удалены. На рисунке 2 показан пластины HBA, на котором разбавляется гомогената селезенки от одной мыши культивировали. Там должно быть явное снижение числа колоний, как коэффициент разбавления становится выше, например, что подсчет различных КОЕ можно, по крайней мере, два разведения. Если мышь расчистил Listeria инфекции (т.е. предел обнаружения = 100 КОЕ / ткань), то <5 Listeria колонии будет присутствовать на пластине HBA, что было распространено 200 мкл неразбавленного гомогената ткани. Если функции печени и / или селезенки подвергнуться заражению кишечными или других внешних бактерий во время изоляции, колонии на пластине HBA, скорее всего, имеют разную морфологию (т.е. не будет иметь характерный ореол и бледный цвет колонии Listeria) и / или могут быть отличается в колонии рассчитывает на то, что ожидается для листерий (то есть слишком мало или слишком много). На рисунке 3 показана типичная кривая Listeria зазор для C57BL / 6 мышей - отмечают, что листерии, как правило, очищается быстрее из селезенки, чем печень и что клиренс не бывает до пяти дней после заражения.

Рисунок 4 показывает клеток на основе одностенных клеточные суспензии, приготовленные из селезенки и печени зараженных мышей в различные моменты времени после заражения. Этот метод может достичь> 95% лейкоцитов чистоты в одноклеточных суспензий, приготовленных из печени и> 80% по сравнению с селезенкой. Лейкоцитов чистоты может быть определено FACS анализ с использованием моноклональных антител, специфичных для пан-лейкоцитарный маркер CD45 (клон 30-F11). Как правило, число спленоцитов и печеночной лейкоцитов увеличение в течение периода, которое требуется, чтобы очистить инфекция печени выставке большее кратное увеличение печеночных лейкоцитов, но существенно меньше общего, по сравнению с увеличением спленоцитов в селезенке. Тип и количество иммунных клеток можно определить по маркировке одноклеточных суспензий с антителами, специфичными для клеточной поверхности маркеры. Маркированный клетки могут быть обнаружены с помощью анализа FACS. На рисунке 5 обеспечивает представителя результаты для CD8 ⁺ Т-клеток. Во время стандартных Listeria инфекции в C57BL / 6 мышей, количество CD8 ⁺ Т-клеток временно уменьшается из-за лимфопения в селезенке на 2-3 дней ДОэлектронной увеличении заметно из 5-й день после заражения и в селезенке и печени.

Рисунок 1. HBA пластины с прожилками Listeria. Стерильные прививки цикл был использован для полосы Listeria от замороженных фондовом глицерина. Пластины инкубировали при 37 ° С в течение ночи. Характерный ореол, окружающий отдельных колоний происходит из-за β-гемолиз.

Рисунок 2. Гомогената ткани из Listeria-инфицированных мышей культивировали на пластинах HBA. Печень был собран из Listeria-инфицированных C57BL / 6 мышей через 3 дня после заражения. Гомогената ткани был подготовлен и разведения размещены в 100 мкл полную тарелку спред для разведения 10 ^-4 (А) и 10 ^-5 разбавления (Б), а также 25 мкл капли на пластине HBA для каждого разбавления 1:10 от неразбавленного до 10 ^-5 (С). Чашки инкубировали при температуре 37 ° С в течение ночи. Разведений, которые позволяют подсчета отдельных колоний используются для определения бактериальной нагрузки (т.е. КОЕ / ткани) в тот момент времени после заражения.

Рисунок 3. Listeria нагрузки в селезенке и печени инфицированных мышей C57BL / 6 на 3 и 7 дней после заражения. C57BL / 6 мышей были инфицированы ~ 2000 КОЕ Listeria. В каждый момент времени, мышей euthanased, печень перфузии и убирают с селезенкой и разведения гомогената селезенки (А) или печеночной одной клеточной суспензии (B) культивировали на чашках HBA для определения бактериальной нагрузки. Сплошные линии указывают среднее геометрическое, а вертикальные полоски показывают SEM. Пунктирная линия показывает, что предел обнаружения для точного измерения бактериальной нагрузки составляет 100 КОЕ / органа для этого эксперимента.

Рисунок 4. Жизнеспособных телец для тканей от инфицированных мышах. C57BL / 6 мышей были инфицированы ~ 2000 КОЕ Listeria. В каждый момент времени, мышей euthanased, печени и перфузии, собранных вместе с селезенкой. Клетки окрашивали трипанового синий и рассчитывал использованием hemacytometer, как описано в шаге 5.9 (). Спленоцитов (B) и печеночной лейкоцитов (C) рассчитывает получить от одноклеточных суспензий, приготовленных из Listeria-инфицированных мышах. Линии указывают среднее геометрическое.

Рисунок 5. FACS анализ CD8 ⁺ Т-клеток в Listeria-инфицированных мышах. C57BL / 6 мышей были инфицированы ~ 2000 КОЕ Listeria. В каждый момент времени, мышей euthanased, печени и перфузии, собранных вместе с селезенкой. Single-клеточные суспензии, окрашивали антителами, специфичными для Т-клеток (CD3, TCRβ, CD4, CD8). () Представитель FACS профилей с% CD8 ⁺ Т-клеток + / - SEM. (B) Всего CD8 ⁺ Т-клеток в селезенке. (C) Всего CD8 ⁺ Т-клеток в печени.

Обсуждение

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Лошадь кровяной агар база № 2	Oxoid	CM0271	Подготовка агара базу для пластин HBA
Лошадь крови (дефибринированной)	Oxoid	HB1000	Добавить 5-10% до агар базы
Мозг сердце инфузии (BHI) бульон (10 мл)	Oxoid	TM456
Мозг сердца настой обезвоженной СМИ	Oxoid	CM1135
96-луночного плоской пластине нижней	BD Biosciences	353072
70 мкм ячейки фильтра	BD Biosciences	352350
Малые чашки Петри	BD Biosciences	351007
Корсаж 80 Biomaster лабораторной системе	Сьюард
Пластиковые пакеты корсаж	Sarstedt	86 9924 530
Бычий сывороточный альбумин	Сигма	A3912
FACS буфера			0,1% (м / о) бычьего сывороточного альбумина в ФБС
Изотонический Перколла (33,75% Перколла в PBS)	GE Healthcare	17-0891-01	33.75mL Перколла, 3.75mL 10х PBS, 62.5mL 1x PBS составляет 100 мл изотонического Перколла
TAC буфера			17мм Tris, 140 мм хлорида аммония в дистиллированной воде
ФТС / ЭДТА буфер			Фетальной телячьей сыворотки с 10 мМ ЭДТА
FACS / ЭДТА буфер			FACS буфера + 5 мМ ЭДТА
Трипановый синий	Сигма	T6146	0,4% (м / о) в PBS, фильтр стерилизовать
2 мл криопробирку	Greiner Bio Один	121263
27 gauge/1mL шприц инсулина	Terumo изделий медицинского назначения	SS10M2713
Игла	Terumo изделий медицинского назначения	NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Шприц	Terumo изделий медицинского назначения	SS-01Т (1 мл), SS-053 (5 мл), SS-10S (10 мл)