מדידת עומס בקטריאלי ותגובות החיסון של עכברים נגועים עם חיידקי ליסטריה</em

Summary

חיידקי ליסטריה הוא אורגניזם מודל ללימוד המערכת החיסונית ורגישות גנטית תאיים לחיידקים בעכברים. שיטה זו מאפשרת למדוד עומס חיידקים ליצור תא בודד השעיות של הכבד והטחול מעכברים לניתוח FACS לקבוע שינויים בתאי המערכת החיסונית עקב זיהום ליסטריה.

Abstract

חיידקי ליסטריה (ליסטריה) הוא הפתוגן גראם חיוביים שברשות תאיים ^1. מחקרים מאוס בדרך כלל להעסיק הזרקה תוך ורידית של ליסטריה, שתוצאתה זיהום מערכתי ^2. לאחר ההזרקה, ליסטריה במהירות מפיצה את הטחול והכבד בשל ספיגת ידי ⁺ תאים דנדריטים ותאי CD8α Kupffer ^3,4. Phagocytosed פעם, חלבונים חיידקי ליסטריה שונים לאפשר להימלט phagosome, לשרוד בתוך cytosol, ואת להדביק תאים שכנים ^5. במהלך שלושת הימים הראשונים של זיהום, שונה תאים חיסוניים מולדים (כגון מונוציטים, נויטרופילים, תאים NK, תאים דנדריטים) לתווך מנגנוני bactericidal כי למזער את התפשטות ליסטריה. CD8 ⁺ T תאים מגויסים לאחר מכן אחראי על פינוי עתידי של ליסטריה מהמחשב המארח, בדרך כלל תוך 10 ימים של זיהום ^6.

פינוי מוצלח של ליסטריה מן עכברים נגועים תלוי תחילת המתאים התגובות מארח החיסון ^6. יש מגוון רחב של רגישויות בין זנים טהורים עכבר ^7,8. באופן כללי, בעכברים עם רגישות מוגברת לזיהום ליסטריה מסוגלים פחות לשלוט התפשטות חיידקים, הוכחת עומס חיידקי מוגבר ו / או אישור מושהה לעומת עכברים עמידים. מחקרים גנטיים, כולל ניתוחים הצמדה עכבר זנים בנוקאאוט, זיהו גנים שונים אשר משפיע על וריאציה רצף התגובות מארח לזיהום ליסטריה ^6,8-14. קביעת והשוואה של קינטיקה זיהום בין זנים שונים העכבר ולכן שיטה חשובה לזיהוי גורמים גנטיים מארח שתורמים התגובות החיסוניות נגד ליסטריה. השוואה בין תגובות המארח ליסטריה זנים שונים גם דרך יעילה לזהות גורמים ארסיות חיידקים שעשויים לשמש מטרות פוטנציאליות עבור טיפול אנטיביוטי או עיצוב החיסון.

אנו מתארים כאן שיטה פשוטה למדידת עומס בקטריאלי (יחידות המושבה להרכיב [CFU] לכל רקמה) והכנת תא בודד השעיות של הכבד והטחול לניתוח FACS של התגובה החיסונית של ליסטריה עכברים נגועים. שיטה זו שימושית במיוחד עבור אפיון ראשוני של זיהום ליסטריה בשנת זנים עכבר הרומן, כמו גם השוואה של התגובה החיסונית בין זנים שונים העכבר נגוע ליסטריה. אנו משתמשים חיידקי ליסטריה EGD זן ^15, כאשר בתרבית על אגר דם, תערוכות אזור הילה מאפיין סביב המושבה כל בשל המוליזה ^β-1 (איור 1). עומס חיידקים התגובה החיסונית ניתן לקבוע בשלב-עת לאחר זיהום על ידי homogenate culturing רקמות על צלחות אגר דם והכנת תא השעיות רקמות לניתוח FACS באמצעות פרוטוקולים כמתואר להלן. היינו לציין כי אנשים הם immunocompromised או בהריון לא צריכה להתמודד עם ליסטריה, ואת הרלוונטיות מוסדיים biosafety ועדה וניהול חיה מתקן יש להתייעץ לפני העבודה מתחילה.

Protocol

1. Culturing ו אחסון לטווח ארוך של חיידקי ליסטריה (ליסטריה)

1. בצע או לרכוש מראש שנעשו דם סוס אגר (HBA) צלחות. צלחות יבש לפני השימוש על ידי מראש דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או הצבת חשפו בארון זרימה למינרית שעה 1.
2. השג ליסטריה קיימא מתוך אחת מהפעולות הבאות: עכבר רקמות נגועים homogenate, מניה lyophilized, מניה גליצרול קפוא, או מושבה מתרבות ליסטריה האחרונות (כלומר פחות מאחוז אחד בשבוע ישנים לא משנה מתורבת יותר מ -10 דורות) . ליסטריה כל יש לקבל באמצעות לולאה inoculating סטרילית העסקת טכניקות aseptic לכל השיטות שתוארו בפרוטוקול זה.
3. פס ליסטריה על ¼ משטח צלחת כמו התפשטות inoculum עיקריים: ליסטריה על צלחת HBA כפי שמוצג באיור 1 באמצעות לולאה inoculating סטרילי Streak. ביצוע סדרה של פסים חד כיווני מן התפשטות הראשי. חזור על פסים 2-3 פעמים באמצעות לולאה טרי או מחדש מעוקרים לפני כל קבוצה של סימנים. דגירה צלחות ב 37 ° C במשך הלילה.
4. חנות ליסטריה צלחת HBA ב 4 ° C למשך תקופה מקסימלית של חודש 1 או ללכת צעד 1.5 להכין תרבות ליסטריה עבור אחסון לטווח ארוך.
5. פיק מושבה אחת מתרבות ליסטריה טרי על צלחת HBA באמצעות לולאה inoculating מעוקרים לחסן 10 מ"ל של עירוי מוח לב (BHI), מרק (להכין לפי הוראות היצרן) ב בקבוק 30 מ"ל מקרטני.
6. דגירה התרבות ליסטריה ב שייקר מסלולית ב 180rpm ב 37 ° C במשך הלילה.
7. הוסף גליצרול 80% סטרילי (v / v) לתרבות ליסטריה נוזלי ביחס של 1:1 כדי להשיג ריכוז גליצרול סופי של 40% (v / v). העברת aliquots 0.5-1 מ"ל לתוך cryovials ולאחסן מניות ליסטריה / גליצרול ב -70 ° C.

טיפים והערות:

• צמיחה של ליסטריה יכול להיות נתמך על הלא סלקטיבי מדיה שונים, כגון מגוון של אגר דם (בתוספת כבשים סוס, חזיר ים או דם אדם), בלב במוח עירוי (BHI) אגר או מרק, או מרק סויה tryptic עם שמרים תמצית (TSB-ye). צמיחה לזהם ניתן למזער בתרבות ידי הוספת אנטיביוטיקה לתקשורת עבור זנים ליסטריה עם עמידות לאנטיביוטיקה מוגדר (למשל חיידקי L. 10403S), או באמצעות אמצעי התקשורת אוקספורד, אשר סלקטיבי לתמוך בצמיחה של ליסטריה.
• אם ליסטריה מתקבל ממקור שלא נבדק, מומלץ כי בדיקות נוספות שיש לבצע כדי לוודא את זהותו של ליסטריה (חיידקי L. הוא חיובי גראם, שאינו נבג טביעה, ניעתי ב <30 מעלות צלזיוס, אנאירובי facultatively, חיובי Catalase, ו אוקסידאז שלילי). תרבות השיג ניתן גם לגדל על התקשורת סלקטיבית ליסטריה על מנת להבטיח כי תרבות טהור מתקבל.
• ייבוש צלחות HBA מבטיחה כי יש הפרדה אופטימלית של מושבות חיידקים בצלחת.
• בעת ביצוע מניות גליצרול קפוא של ליסטריה, להשתמש טרי תרבויות HBA ליסטריה, כי הם פחות מ 1 שבוע הישן תת תרבות במשך דורות מעטים ככל האפשר (<5 הוא הטוב ביותר).
• כאשר ליסטריה שמקורם בתרבויות טריים מלאי גליצרול קפוא, הקטע הראשון צריך להיעשות על בינוני מוצק (כלומר צלחות HBA) כי השיג ליסטריה ממניות גליצרול קפוא לגדול בצורה גרועה כאשר subcultured ישירות במדיום נוזלי.

2. הכנה ואחסון של מלאי זיהומיות ליסטריה עבור vivo במחקרים זיהום

1. Streak ליסטריה ממלאי גליצרול קפוא (שלב 1.7) על צלחת HBA כמתואר בשלב 1.3. דגירה צלחות ב 37 ° C במשך הלילה לשימוש ביום הבא.
2. פיק מושבה ליסטריה אחד מתרבות פס ו לחסן 10 מ"ל BHI מרק. הימנע העברת אגר לתוך המרק.
3. דגירה התרבות ליסטריה BHI ב שייקר מסלולית ב 180 סל"ד ו - 37 ° C לשלב אמצע לוגריתמי (OD600 = ~ 0.4). זה בדרך כלל לוקח 3-4 שעות.
4. קחו aliquot 0.9 מ"ל בסביבה נקייה מחיידקים, ולקבל קריאה OD ב 600 ננומטר ב 3-4 שעות של רעד. אם OD הקריאה <0.3, ולאחר מכן להמשיך תרבות שייקר מסלולית ב 180 סל"ד ו - 37 ° C עד קריאת OD הוא ~ 0.4.
5. הוסף 1 מ"ל סטרילי 80% גליצרול (v / v) עד 10 מ"ל ליסטריה תרבות מרק BHI (OD600 ~ 0.4). מערבבים בעדינות ולהעביר לתוך צינורות 1.5 מ"ל microfuge ב 0.5-1 aliquots מ"ל.
6. מניחים את aliquots על קרח דק 10 ולאחסן ב -70 ° C. השאר אחד aliquot יצאה מן ההקפאה, כדי לקבוע את הריכוז של ליסטריה במלאי זיהומיות, שהוא בדרך כלל בסדר גודל של 10 ⁹ CFU / ml.
7. בצע 1:10 דילולים סדרתי של unfroזן מניות זיהומיות ליסטריה ב PBS על דילול ^-8 10. מורחים 100 μL של חי ואת כל הבאים על דילול מראש יבשים צלחות HBA (שלב 1.1) בשני עותקים באמצעות מפזר זכוכית. דגירה צלחות ב 37 ° C במשך הלילה.
8. ספירת מושבות על כל צלחת ולקבוע את ריכוז ליסטריה התרבות מניות קפוא זיהומיות באמצעות החישוב הבא: ריכוז (CFU / mL) = מספר מושבות x גורם לדילול / 0.1 מ"ל. צלחות נבחר ספירת אידיאלי צריך להיות 30-300 המושבות כדי להבטיח הערכה אמינה של ריכוז CFU של חיידקים קיימא.
9. ימים ספורים לאחר לאחסון מלאי זיהומיות ליסטריה ב -70 ° C, להפשיר צינור אחד. קבע את הריכוז של ליסטריה קיימא כמתואר צעדים 2.7 ו 2.8. ריכוז זה צריך להיות דומה לזה שנקבע המניה זיהומיות מוכן טרי בשלב 2.8.

טיפים והערות:

• מניות זיהומיות ליסטריה קפוא ב גליצרול אחוז נמוך יותר (8%) מאשר ליסטריה קפוא עבור אחסון לטווח ארוך כללית (40%).
• קפוא מניות זיהומיות ליסטריה הם בדרך כלל יציב -70 ° C עד 3 חודשים. אם באמצעות מעבר 3 חודשים, מומלץ כי מלאי זיהומיות חדש להיות מוכנים מתרבות ליסטריה טרי על צלחת HBA.
• אם הריכוז של מניות מופשר זיהומיות ליסטריה (שלב 2.9) הוא שונה המניה מוכן טרי כמתואר צעדים 2.7 ו -2.8 (ירידה כלומר> 20% CFU), ואז המניה חדש זיהומיות קפוא צריך להיות מוכן.
• אמנם זמן רב יותר מאשר בתחילה הכנת inoculum חיידקי טרי עבור ניסוי בודד, הכנת קפוא מניות זיהומיות ליסטריה מאפשר קביעה מדויקת של ריכוז CFU לפני זיהום ועקביות טוב יותר בין הניסויים כאשר עכברים נגועים ממלאי הקפוא אותו.

3. הכנת inoculum ליסטריה ו הזרקה תוך ורידית של עכברים

1. קבע את הריכוז של ליסטריה להיות מוזרק לכל עכבר. עבור הזרקה תוך ורידית, CFU ב inoculum 200 μL לכל העכבר משמש.
2. להפשיר aliquot קפוא של המניה זיהומיות ליסטריה (מ שלב 2.6). לדלל את המניות זיהומיות PBS את הריכוז הרצוי CFU ליסטריה. פעמיים נפח הדרושים הזרקת כל העכברים על מנת להבטיח כי יש מספיק inoculum להזרקה והנחישות של ליסטריה CFU לפני ואחרי הזרקת (שלב 3.3 ו -3.7).
3. הסר 2x 0.1 aliquots מ"ל מן inoculum ליסטריה מוכן, להכין דילול 1:10 ב PBS עבור aliquot לפני כל זריקה של עכברים. צלחת 0.1 מ"ל של כל דילול על צלחות HBA ו דגירה צלחות לילה בשעה 37 ° C. ספירת מושבות ולקבוע את ריכוז מראש הזרקת inoculum ליסטריה: ריכוז (CFU / מ"ל) = (מספר מושבות x גורם דילול) / mL מצופה עבור גורם לדילול.
4. העברת העכבר להיות מוזרק לתוך הכלוב נקי. חם העכבר על ידי הצבת את הכלוב ~ 50 ס"מ מתחת לפנס אינפרא אדום 250 וואט במשך 5 דקות (מתאים למכשירים אחרים תרמית שלא ישרוף את העכבר או להעלות את הטמפרטורה של הכלוב מעל 40 ° C יכול לשמש גם). מניחים את העכבר בהתקן ריסון זריקות לווריד הזנב.
5. בעדינות מערבבים את ההשעיה ליסטריה לשמור על ההשעיה עקבי בכל פעם מזרק נטען.
6. אתר את וריד הזנב לרוחב של העכבר, לנגב בעדינות עם אתנול 70% לנגב להזריק 200 μL של inoculum ליסטריה (בריכוז הרצוי) באמצעות מזרק עם מחט מד 27. בקצרה להפעיל לחץ על הפצע כניסה עם גזה סטרילית. החזר את העכבר לכלוב שלה.
7. כאשר הזריקה של עכברים כל הושלמה, חזור על שלב 3.3 באמצעות יתרת הסכום של inoculum כדי לקבוע את הריכוז שלאחר הזרקת inoculum ליסטריה.
8. כמות הזריקו לעכברים ליסטריה הוא כפי שדווח CFU הממוצע נקבע מן לפני ואחרי הזרקת דגימות inoculum ליסטריה.

טיפים והערות:

• אנחנו בדרך כלל להזריק 500 - 3000 CFU (200 μL של 2500 CFU / mL - 15,000 CFU / mL inoculum) כאשר משווים עומס חיידקים תגובות חיסוניות בין זן עמיד העכבר (למשל C57BL / 6), זן עכברים רגישים (למשל BALB / c ).
• אם המניות זיהומיות יהיה מדולל PBS על ידי לפחות 10 ^5, אז צעד כביסה אינה נדרשת בדרך כלל כדי להסיר התקשורת שיורית / גליצרול. אם המניות זיהומיות לא יהיה מדולל PBS על ידי לפחות 10 ^5, אז צעד כביסה יש להוסיף בשלב 3.2 להסיר התקשורת שיורית / גליצרול כדלקמן:dd 9 מ"ל PBS למלאי זיהומיות חיידקים מופשר שנאספו על ידי צנטריפוגה XG ב 2100 ב 10 דקות 4 ° C. הסר supernatant ו resuspend תאים חיידקיים pelleted ב 10 מ"ל סטרילי PBS, צנטריפוגה חוזרת, resuspend תא חיידקי גלולה בהיקף הרצוי. קבע את CFU הממוצע של לפני ואחרי הזרקת דגימות inoculum ליסטריה כמתואר שלב 3.3 ו -3.7. יצוין, כי צעד זה כביסה עלול לגרום לאובדן חלק חיידקים, מומלץ כי הפסד כזה נקבע מראש ומטופלות בקבלת inoculum הריכוז הנדרש.
• בבטחה להשליך מזרק ומחט לאחר הזרקת עכבר עם ליסטריה.

4. הסרת הכבד והטחול מ ליסטריה עכברים נגועים לניתוח

1. Euthanase העכבר נגוע בנקודה הרצויה זיהום שלאחר זמן בשיטה אושרה על ידי בעלי חיים המקומי, ועדת האתיקה, כגון מחנק CO _2.
2. בצע לדמם לב מיד לאחר המתת חסד באמצעות מזרק 1 מ"ל ו - 25 מחט מד. איסוף דם רב ככל האפשר. הסרת כיס המרה ולנתק הנחות הווריד הנבוב.
3. לחשוף את וריד שער הכבד על ידי בקפידה דוחפים המעיים ימינה, להפוך את אונות הכבד לעבר הראש שמאלה כך הכבד הוא יושב שם הסרעפת ממוקם. וריד שער הכבד הזנות לתוך החלק התחתון של הכבד מן הצד הימני התחתון.
4. Perfuse את הכבד על ידי הזרקת 10 מ"ל PBS לתוך וריד שער הכבד באמצעות מחט מד 26. PBS מוזרק דרך וריד הפורטל יהיה לצאת מן ניתק נחות הווריד הנבוב. זלוף כבד מבטיחה כי התאים הם קוצרים מהכבד ולא במחזור הדם.
5. הסר את הכבד perfused מחלל הגוף של העכבר, מקום חיץ FACS, ולאחסן על הקרח. עבור לשלב 5.1 להכנת הכבד לניתוח FACS.
6. הסר את הטחול מהעכבר, מקום חיץ FACS, ולאחסן על הקרח.
7. לשקול את הטחול שלם, לחתוך לחצי, ולשקול את אחד החצאים. מקום אחד וחצי חיץ FACS ועבור לשלב 6.1. מניחים את החצי השני בשקית במחוך על הקרח ועבור לשלב 7.1.

טיפים והערות:

• בשנת צעדים 4.5 ו 4.6, השתמש מספיק חיץ FACS לצלול לחלוטין את הרקמה כדי למזער את החשיפה של כל חלק של רקמת לאוויר.
• אורך 26 סנטימטר וחצי מחט מד כי הוא כפוף על ידי ~ 30 מעלות יכול להקל יותר הזרקה לווריד של PBS הפורטל הכבד.
• כאשר perfused כראוי, הכבד הופך מצבע אדום כהה עד חום בהיר לאחר הזרקת 1-2 מ"ל PBS.
• אם הכבד אינו נדרש לניתוח FACS, זלוף לא הכרחי. הכבד יכול להיות מבודד ואסף ישירות לתוך שקית במחוך ומעובד כמתואר בשלב 7.
• לגבי המתת חסד של עכברים, CO ₂ מחנק היא השיטה המועדפת, כי יש לו השפעה מינימלית על CFU חיידקים כדאיות התא החיסונית הטחול והכבד. אם איסוף הדם אינו נדרש, נקע בצוואר הרחם עשויה לשמש כשיטה חלופית המתת חסד. מומלץ שיטות המתת חסד שעשויים להשפיע על משקל איבר או הכדאיות תא החיסון לא ניתן להשתמש (thiobarbiturates למשל).

5. הכנת ההשעיה תא הכבד לניתוח FACS

1. צור תא בודד השעיות ידי הצבת כבד עם FACS חיץ (שלב 4.5) ב מסננת 70 מיקרומטר התא נמצא בתוך צלחת פטרי 60 מ"מ. דחוף את רקמת דרך מסננת התא באמצעות הבוכנה של מזרק 5 מ"ל עד ההשעיה תא בודד נוצר.
2. מעבירים את ההשעיה תא בודד הכבד מצלחת פטרי אל צינור 50 מ"ל הברגה כובע חרוטי ולהביא את הנפח הכולל עד 40 מ"ל עם חיץ FACS קר.
3. תא וורטקס ההשעיה ולקחת aliquot 1 מ"ל לקבוע עומס חיידקי עבור הכבד. עבור לשלב 7.3 ולהשתמש aliquot 1 מ"ל במקום homogenate רקמות בשקית במחוך.
4. תאים גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 500 דקות 5 ב 4 ° C, להשליך supernatant, resuspend גלולה ב 40 מ"ל חיץ FACS קר, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 500 עבור 5min ב 4 ° C, וזורקים supernatant.
5. Resuspend התא גלולה ב Percoll 20 מ"ל איזוטוני בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 700 12 דקות בטמפרטורת החדר. מחק גיליון supernatant ו דיסק כמו של תאים צפים על גבי (כלומר hepatocytes). Resuspend ליקוציט המכילים גלולה במאגר 4 TAC מ"ל ל lyse אריתרוציטים ותאי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם היפוך תכופים.
6. תא ההשעיה סינון דרך קרום 100 מיקרומטר ניילון לתוך צינור צנטריפוגות חדשות 10 מ"ל.
7. ביסוד מסוננים ההשעיה תא עם חיץ 1 FCS / מ"ל ​​EDTA. צנטריפוגה ב XG 350 עבור5 דקות ב 4 ° C, להשליך supernatant ו resuspend במאגר FACS 5 / מ"ל ​​EDTA.
8. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 350 דקות 5 ב 4 ° C, להשליך supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר 0.5-3 FACS / מ"ל ​​EDTA בהתאם לגודל של גלולה.
9. מדולל ההשעיה תא 1:05-01:20 ב trypan כחול בהתאם לכמות השעיה בשלב 5.8. ספירת לויקוציטים הכבד קיימא באמצעות hemacytometer (איור 4 א) ולקבוע תאים קיימא סך כדלקמן: תאים קיימא / איבר = מספר התאים הגורם ספירת x שטח דילול x 10 ⁴ x נפח (מ"ל). תא בודד השעיות כבד אז יכול להיות מתויג עם נוגדנים ספציפיים על פני קרום התא סמנים הרצוי ונותחו על ידי FACS.

טיפים והערות:

• שמור את התאים על הקרח אלא אם צוין אחרת.

6. הכנת ההשעיה תא בודד הטחול לניתוח FACS

1. צור תא בודד השעיות ידי הצבת מחצית הטחול (שלב 4.7) עם חיץ FACS בתוך מסננת 70 מיקרומטר התא נמצא בתוך צלחת פטרי 60 מ"מ. דחף בעדינות את הרקמות דרך מסננת התא באמצעות הבוכנה של מזרק 5 מ"ל עד ההשעיה תא בודד נוצר.
2. מעבירים את ההשעיה תא בודד הטחול מצלחת פטרי אל צינור מ"ל 10 צנטריפוגות ולהביא את הנפח הכולל עד 10 מ"ל באמצעות קר חיץ FACS.
3. תאים גלולה ידי צנטריפוגה XG ב 350 דקות 5 ב 4 ° C, להשליך supernatant, resuspend תא גלולה במאגר 4 TAC מ"ל ל lyse אריתרוציטים, תאים דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם היפוך תכופים.
4. תא ההשעיה סינון דרך קרום 100 מיקרומטר ניילון לתוך צינור צנטריפוגות חדשות 10 מ"ל.
5. ביסוד מסוננים ההשעיה תא עם חיץ 1 FCS / מ"ל ​​EDTA. צנטריפוגה XG ב 350 דקות 5 ב 4 ° C, להשליך supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר FACS 5 / מ"ל ​​EDTA.
6. צנטריפוגה ההשעיה התא XG 350 דקות 5 ב 4 ° C, להשליך supernatant ו resuspend תא גלולה במאגר 3-8 FACS / מ"ל ​​EDTA בהתאם לגודל של גלולה.
7. מדולל ההשעיה 1:10 תא - 1:20 ב trypan כחול (0.4% ב מים מזוקקים) בהתאם לכמות השעיה בשלב 7.6. הרוזן splenocytes קיימא באמצעות hemacytometer - ראה שלב 5.9 לחישוב תאים קיימא הכולל לכל איבר הטחול תא בודד השעיות אז יכול להיות מתויג עם נוגדנים ספציפיים על פני קרום התא סמנים הרצוי ונותחו על ידי FACS.

טיפים והערות:

1. שמור את התאים על הקרח אלא אם צוין אחרת.

7. מדידה של עומס חיידקי ליסטריה ברקמות מן עכברים נגועים

1. מקפלים את החלק העליון של השקית במחוך המכיל חצי הטחול. בעוד מחזיק את תיק במחוך לסגור כדי למנוע דליפה, ולהניח אותה על ספסל שטוח נקי או בארון זרימה למינרית. רול עט עגול עבה מעל הרקמה עד רקמה היא מחית בתוך התיק.
2. הוסף 5 מ"ל של PBS על כל שקית במחוך המכיל רקמות מחית. מניחים את השקית לתוך במחוך במחוך, ולהפעיל את במחוך על מהירות גבוהה במשך 10 דקות.
3. מערבבים את homogenate בתיק במחוך (או aliquot 1 מ"ל של השעיה תא הכבד) עם טפטפת. בצעו את הפעולות הבאות ב כפילויות. העברת 300 μL לצלחת התחתונה 96-גם שטוח. בתוך בארות הצלחת 96-היטב לבצע דילולים 1:10 סדרתי (30 μL לתוך 270 PBS μL) כדי דילול של 10 ^-5 עבור כל דגימה רקמה homogenate.
4. בזהירות להפיץ 0.1 מ"ל של דילול כל לצלחת HBA מראש יבשים מפזר באמצעות זכוכית. דגירה צלחות ב 37 ° C במשך הלילה.
5. ספירת CFU עבור דילול כל לחשב את CFU לכל רקמה לוקחים בחשבון את החלק של רקמות (למשל חצי הטחול), גורם לדילול, ואת הנפח הכולל של homogenate רקמות (5 מ"ל או 40 מ"ל): CFU / רקמה = CFU/0.1 מ"ל x גורם לדילול x mL / רקמות; עבור בטחול לחלק מספר זה לפי משקל אחוז המדגם הטחול משמש homogenization רקמות (ראה שלב 4.7).

טיפים והערות:

• יותר מאחד תיק במחוך ניתן להציב את במחוך בכל פעם כל עוד הנפח הכולל אינו עולה על נפח מרבי כפי שצוינו על ידי היצרן
• אם במחוך אינו זמין, homogenizer רקמות יכול לשמש במקום. לחלופין, השיטה הבאה, אם כי לא יעיל כמו, יכול לשמש גם באופן ידני מרוכך האיבר במקום צעדים 7.1 ו 7.2: איבר מקום בשקית פלסטיק אטומה מעוקרים ומניחים על ספסל נקי בעוד מחזיק את התיק סגור כדי למנוע דליפה . רול 500 מ"ל בקבוק זכוכית מעבדה שוב ושוב על התיק עד רקמה היא מחית ביסודיות. הוסף 5 מ"ל של PBS על כל שקית לשלב 7.3.
• חשוב מאוד בשלב 7.4 כי צלחות HBA להיות יבשים לחלוטין(כלומר ללא לחות על אגר). אחרת זה עלול להיות קשה להשיג מושבות ליסטריה ברורה כי ניתן לספור כמו שצריך.
• אם יש מוגבלים צלחות HBA, צעד אלטרנטיבה 7.4 היא: ציור קווים על החלק התחתון של צלחת HBA מראש יבשים (שלב 1.1) לחלק אותו לתוך 5-6 חלקים, אחד עבור כל דילול. בזהירות פיפטה 25 μL של דילול כל למקטעים המתאימים על הצלחת HBA עבור homogenate כל רקמה - אינם מתפשטים עם מפזר. המתן עד טיפות homogenate רקמות יבשות לפני הצלחת היפוך. דגירה צלחת ב 37 ° C במשך הלילה. עד 80 מושבות ניתן להבחין בשל טיפה אחת על צלחת אגר.
• דילול של homogenates רקמה תלויה הצמיחה ליסטריה בשנת החיה ניתן להעריך על סמך התסמינים המוצגים על ידי החיה בזמן של המתת חסד. לגבי עכברים כי הם הגוססת ניכרת, אז דילולים נוסף עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר את העומס חיידקי. עבור עכברים מחוסן עם מינונים נמוכים של ליסטריה או עכברים euthanased בסוף תקופת ההדבקה, homogenate רקמות חי ניתן להשתמש כדי לקבוע את עומס חיידקי.
• פלטות ניתן מודגרות ב 37 ° C במשך הלילה או בטמפרטורת החדר למשך 2-3 ימים.

8. נציג תוצאות:

לצורך ניסוי דלקת רגילה, ליסטריה התקבל מלאי גליצרול קפוא מפוספס על צלחת HBA כפי שמוצג באיור 1. אם המושבות מעטים מתקבלים לאחר פסים, זה עשוי להצביע על פסים עניים או פחות מניות קפוא אופטימלית. מניות זיהומיות ליסטריה הוכן מהצלחת HBA מפוספס טרי המאוחסן ב -70 ° C. עבור מדידת אישור חיידקים התגובה החיסונית, אנו שגרתי לדלל את המניות מופשר זיהומיות ליסטריה על 2500 CFU / mL - 15,000 CFU / מ"ל ו להזריק עכברים עם 200 μL להדביק אותם עם 500 - 3000 CFU. אנו צופים כי עכברים נגועים משנה קטלנית במינונים של ליסטריה בפרוטוקול זה עשוי transiently התערוכה פרווה פרועות, יציבה כפופה וירידה במשקל בתוך בימים הראשונים. תסמינים אלה לספק רמז חזותי, כיצד קשות עכבר הפרט מושפע הזיהום, אם זה מגיב אחרת משאר הקבוצה (כלומר outlier "מובן מאליו"), והאם יש צורך המתת חסד כדי למנוע סבל מוגזם המוות הקרב עקב הזיהום.

בתוצאות מיוצג על ידי דמויות 2-5, עכברים נדבקו באמצעות aliquot מופשר טרי של המניה זיהומיות ליסטריה. בנקודות זמן שונות לאחר הפגיעה, העכברים היו euthanased והכבד והטחול הוסרו. איור 2 מראה על צלחת HBA אשר homogenate הטחול מדולל של העכבר יחיד היה תרבותי. לא צריך להיות ירידה ברורה במספר מושבות כמו הגורם לדילול הופך גבוה יותר, כך לספור CFU ברורים אפשרי לפחות שני דילולים. אם העכבר יש פינה את זיהום ליסטריה (כלומר, להגביל את גילוי = 100 CFU / רקמות), ואז <5 מושבות ליסטריה יהיו נוכחים על הצלחת HBA אשר הופצה עם μL 200 של homogenate רקמות חי. אם והכבד / או הטחול להזדהם עם חיידקים במעיים חיצוני או אחר במהלך בידוד, מושבות בצלחת HBA צפויים להפגין מורפולוגיה שונה (כלומר לא תהיה הילה מאפיין וצבע חיוור של מושבות ליסטריה) ו / או עשויים להיות שונה בספירת המושבה מה צפוי עבור ליסטריה (כלומר, מעט מדי או יותר מדי). איור 3 מראה עקומה טיפוסית אישור ליסטריה לעכברים C57BL / 6 - לב כי ליסטריה נמחקים בדרך כלל מהר יותר מאשר מן הטחול הכבד אישור זה לא יקרה עד חמישה ימים לאחר ההדבקה.

איור 4 מראה ספירת תא המבוסס על תא בודד השעיות מוכן מן הטחול והכבד של עכברים נגועים בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה. שיטה זו יכולה להשיג> טוהר ליקוציט 95% מתא בודד השעיות מוכן מהכבד ו> 80% מן הטחול. טוהר ליקוציט ניתן לקבוע על ידי ניתוח FACS באמצעות נוגדן חד שבטי ספציפי סמן הפאן ליקוציט CD45 (שיבוט 30-F11). בדרך כלל, מספר splenocytes ו leukocytes הכבד להגביר בתקופת שנדרש כדי לנקות את הזיהום הכבד מציג גידול של פי יותר leukocytes הכבד, אבל בסך הכל קטן באופן משמעותי, לעומת עלייה של splenocytes הטחול. סוג ומספר של תאים חיסוניים ניתן לקבוע על ידי תיוג תא בודד השעיות עם נוגדנים ספציפיים על פני קרום התא סמנים. תאים תווית אז יכול להיות מזוהים על ידי ניתוח FACS. איור 5 מספק תוצאות נציג CD8 ⁺ T לתאים. במהלך זיהום ליסטריה תקן בעכברים C57BL / 6, מספר CD8 ⁺ T תאים transiently פוחתת בשל lymphopenia הטחול ב befor 2-3 ימיםדואר הגדלת ניכרת של 5 זיהום שלאחר יום בטחול וגם בכבד.

באיור 1. צלחת HBA מפוספס ליסטריה. לולאה inoculating סטרילי שימש פס ליסטריה ממלאי גליצרול קפוא. צלחת הודגר ב 37 ° C במשך הלילה. ההילה אופיינית סביב מושבות אדם בשל המוליזה-β.

איור 2. רקמות homogenate מהעכבר ליסטריה נגועים תרבותי על צלחות HBA. הכבד היה שנקטפו מן C57BL ליסטריה נגועים / 6 העכבר 3 ימים לאחר הפגיעה. Homogenate רקמות הוכן דילולים להציב כמו צלחת מלאה 100 μl להתפשט עבור דילול 10 ^-4 (א) ו ^-5 דילול 10 (ב), וכן 25 μl טיפות על צלחת HBA עבור דילול כל חי מ 1:10 עד 10 ^-5 (ג). הצלחות הודגרו ב 37 ° C במשך הלילה. דילולים המאפשרים ספירת מושבות הפרט משמשים כדי לקבוע את עומס בקטריאלי (כלומר CFU / רקמה) בנקודת הזמן שלאחר זיהום.

איור 3. לטעון ליסטריה הטחול והכבד של עכברים נגועים C57BL / 6 ב 3 ו 7 ימים לאחר ההדבקה. עכברים C57BL / 6 נדבקו CFU 2000 ~ של ליסטריה. בכל נקודת זמן, העכברים היו euthanased, הכבד היה perfused וקצרו עם הטחול, וכן דילולים של homogenate הטחול (א) או בכבד תא בודד ההשעיה (ב) היו בתרבית על צלחות HBA כדי לקבוע את עומס חיידקי. קווי מוצק מצביעים הממוצע הגיאומטרי, ועל הקווים האנכיים מציינים SEM. הקו המקווקו מציין כי גבול הגילוי עבור מדידה מדויקת של עומס חיידקי הוא 100 CFU / איבר לצורך הניסוי הזה.

איור 4. ספירת תאים קיימא עבור רקמות מן עכברים נגועים. עכברים C57BL / 6 נדבקו CFU 2000 ~ של ליסטריה. בכל נקודת זמן, העכברים היו euthanased, הכבד perfused וקצרו עם הטחול. תאים הוכתמו trypan כחול וספר באמצעות hemacytometer כמתואר שלב 5.9 (A). Splenocyte (B) הכבד לויקוציטים (ג) מונה המתקבל מתא בודד השעיות שהוכן ליסטריה עכברים נגועים. קווים מצביעים הממוצע הגיאומטרי.

איור 5. ניתוח FACS של CD8 ⁺ T תאים נגועים ב ליסטריה עכברים. עכברים C57BL / 6 נדבקו CFU 2000 ~ של ליסטריה. בכל נקודת זמן, העכברים היו euthanased, הכבד perfused וקצרו עם הטחול. תא בודד השעיות הוכתמו נוגדנים ספציפיים עבור תאים T (CD3, TCRβ, CD4, CD8). (א) נציג פרופילים עם FACS% CD8 ⁺ T תאים + / - SEM. (ב) סך CD8 ⁺ T תאים של הטחול. (ג) סך CD8 ⁺ T תאים בכבד.

Discussion

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
דם על סוסים אגר בסיס מס '2	Oxoid	CM0271	הכנת בסיס אגר עבור צלחות HBA
דם על סוסים (defibrinated)	Oxoid	HB1000	הוסף 5-10% לבסיס אגר
הלב והמוח עירוי (BHI), מרק (10 מ"ל)	Oxoid	TM456
הלב והמוח עירוי התקשורת מיובש	Oxoid	CM1135
96-היטב לתחתית צלחת שטוחה	BD Biosciences	353072
תא 70 מיקרומטר מסננת	BD Biosciences	352350
צלחת פטרי קטנים	BD Biosciences	351007
במחוך 80 biomaster מעבדה מערכת	Seward
שקיות פלסטיק במחוך	Sarstedt	86 9924 530
שור בסרום אלבומין	סיגמא	A3912
FACS חיץ			0.1% (w / v) בסרום שור אלבומין PBS
משקה ביד Percoll (33.75% בשנת Percoll PBS)	GE Healthcare	17-0891-01	33.75mL Percoll, PBS 10x 3.75mL, 62.5mL 1x PBS עושה Percoll 100 מ"ל איזוטוני
TAC הצפת			טריס 17mm, אמוניום כלוריד 140mM במים מזוקקים
FCS / EDTA חיץ			עגל בסרום עוברי 10mm עם EDTA
FACS / EDTA חיץ			FACS חיץ + EDTA 5mm
Trypan כחול	סיגמא	T6146	0.4% (w / v) ב-PBS, מסנן מעוקר
2ml Cryovial	גריינר ביו אחת	121263
27 מזרק אינסולין gauge/1mL	Terumo מוצרים רפואיים	SS10M2713
מחט	Terumo מוצרים רפואיים	NN-2516R (25 גרם 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
מזרק	Terumo מוצרים רפואיים	SS-01T (1mL), SS-053 (5 מ"ל), SS-10S (10 מ"ל)