Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Resumo

Listeria monocytogenes é um organismo modelo para estudar as respostas imunológicas e suscetibilidade genética para as bactérias intracelulares em camundongos. Este método permite que sejam medidos carga bacteriana e gerar uma única célula suspensões de fígado e do baço de ratos para análise FACS para determinar mudanças em células do sistema imunológico devido à infecção por Listeria.

Resumo

Listeria monocytogenes (Listeria) é um patógeno Gram-positivas facultativas intracelular ^1. Estudos com camundongos empregam normalmente injeção intravenosa de Listeria, o que resulta em infecção sistêmica ^2. Após a injeção, Listeria rapidamente dissemina para o baço e do fígado devido à absorção pelas CD8α ⁺ células dendríticas e células de Kupffer ^3,4. Uma vez fagocitado, várias proteínas bacterianas permitir Listeria para escapar do fagossomo, sobreviver dentro do citosol, e infectar as células vizinhas ^5. Durante os três primeiros dias de infecção, as células imunes inatas diferentes (por exemplo, monócitos, neutrófilos, células NK, células dendríticas) mediar os mecanismos que minimizam a proliferação bactericida Listeria. Células T CD8 ⁺ são posteriormente recrutados e responsável pelo desembaraço eventual de Listeria a partir do host, geralmente dentro de 10 dias de infecção ^6.

Clearance de sucesso de Listeria de camundongos infectados depende do aparecimento de respostas apropriadas imune do hospedeiro ^6. Há uma ampla gama de sensibilidades entre linhagens de camundongos puras ^7,8. Geralmente, os camundongos com aumento da susceptibilidade à infecção por Listeria são menos capazes de controlar a proliferação bacteriana, demonstrando aumento da carga bacteriana e / ou liberação atrasada em comparação com camundongos resistentes. Estudos genéticos, incluindo as análises de ligação e linhagens de camundongos knockout, identificaram vários genes para os quais variação da seqüência afeta as respostas do hospedeiro à infecção Listeria ^6,8-14. Determinação e comparação da cinética de infecção entre linhagens de camundongos diferentes é, portanto, um importante método para a identificação de fatores genéticos do hospedeiro que contribuem para respostas imunes contra a Listeria. Comparação da resposta do hospedeiro a diferentes cepas de Listeria é também uma forma eficaz de identificar os fatores de virulência bacteriana que pode servir como potenciais alvos para a terapia com antibióticos ou concepção de uma vacina.

Descrevemos aqui um método simples para medir a carga bacteriana (unidades formadoras de colônias [UFC] por tecido) e preparação de suspensões de uma única célula do fígado e do baço para FACS análise das respostas imunes em ratos infectados Listeria. Este método é particularmente útil para a caracterização inicial da infecção por Listeria em linhagens de camundongos romance, bem como a comparação das respostas imunitárias diferentes entre linhagens de camundongos infectados com Listeria. Usamos a Listeria monocytogenes EGD estirpe ¹⁵ que, quando cultivadas em ágar sangue, exibe uma zona de auréola característica em torno de cada colônia, devido à hemólise ^β-1 (Figura 1). Carga bacteriana e resposta imune pode ser determinado em qualquer ponto do tempo após a infecção por homogeneizado de cultura de tecidos em placas de ágar sangue e preparar suspensões de células de tecido para análise FACS utilizando os protocolos descritos abaixo. Gostaríamos de observar que os indivíduos que estão imunocomprometidos ou grávidas não devem manusear Listeria, e os institucionais pertinentes Biossegurança e animal gestão de instalações deve ser consultado antes do início dos trabalhos.

Protocolo

1. Cultivo e armazenamento de longo prazo de Listeria monocytogenes (Listeria)

1. Fazer ou comprar pré-fabricados cavalo ágar sangue (HBA) placas. Chapas secas antes de serem utilizados por pré-incubação a 37 ° C durante a noite ou colocando a descoberto em uma câmara de fluxo laminar por 1 hora.
2. Obter Listeria viável de um dos seguintes: um homogeneizado de tecido infectado mouse, um estoque liofilizado, um estoque de glicerol congelados, ou uma colônia a partir de uma cultura recente Listeria (ou seja, menos de uma semana de idade e não sub-cultivados mais de 10 gerações) . Todos os Listeria devem ser obtidas usando uma ansa estéril inoculação e empregando técnicas assépticas para todos os métodos descritos neste protocolo.
3. Streak Listeria em uma placa HBA como mostrado na Figura 1 usando uma ansa estéril inoculando: raia Listeria mais de ¼ da superfície da placa como a propagação de inóculo primário. Fazer uma série de estrias unidirecional a partir da disseminação primária. Repita estrias 2-3 vezes usando um loop frescos ou re-esterilizados antes de cada conjunto de estrias. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
4. Loja placa HBA Listeria a 4 ° C por um período máximo de 1 mês ou vá para o passo 1.5 a preparar a cultura Listeria para armazenamento de longo prazo.
5. Escolha uma única colônia de uma cultura fresca Listeria em uma placa HBA usando um loop esterilizados inoculação e inocular 10 ml de infusão de cérebro coração (BHI) caldo (prepare de acordo com as instruções do fabricante) em um frasco de 30 mL McCartney.
6. Incubar a cultura Listeria em um agitador orbital a 180rpm a 37 ° C durante a noite.
7. Adicionar glicerol 80% estéril (v / v) para a cultura Listeria líquido a relação 1:1 para obter uma concentração final de glicerol 40% (v / v). Transferência de alíquotas 0,5-1 mL em criotubos e armazenar stocks Listeria / glicerol a -70 ° C.

Dicas e notas:

• Crescimento de Listeria pode ser suportado em diferentes meios de comunicação não-seletivos, como uma gama de agar sangue (suplementado com ovelhas, cavalo, cobaia ou sangue humano), infusão de cérebro coração (BHI) ou caldo de agar, ou caldo tripticase soja com fermento extract (TSB-YE). Crescimento contaminação pode ser minimizada na cultura pela adição de antibióticos aos meios de comunicação para as estirpes com Listeria definido resistência aos antibióticos (por exemplo, L. monocytogenes 10403S), ou usando Oxford mídia, que seletivamente o crescimento de Listeria.
• Se Listeria é obtido a partir de uma fonte não testados, recomenda-se que testes adicionais sejam realizados para confirmar a identidade de Listeria (L. monocytogenes é Gram positivas, não formando esporos, móveis em <30 ° C, anaeróbios facultativos, catalase positiva, e oxidase negativas). A cultura obtida também pode ser cultivada em Listeria meios seletivos para garantir que uma cultura pura é obtida.
• Secagem das placas HBA garante que não há separação ideal de colônias de bactérias na placa.
• Ao fazer stocks glicerol congelados de Listeria, use culturas frescas HBA Listeria que são menos de uma semana de idade e sub-cultura para as gerações menor número possível (<5 é melhor).
• Quando decorrentes fresco culturas Listeria a partir de um estoque de glicerol congelados, a primeira passagem deve ser feita em meio sólido (ou seja, placas HBA), porque Listeria obtidos a partir de stocks de glicerol congelados crescem mal quando diretamente repicadas em meio líquido.

2. Preparação e armazenamento de estoque infecciosas Listeria para estudos infecção vivo

1. Streak Listeria a partir de um estoque de glicerol congelados (Passo 1.7) em uma placa HBA como descrito no passo 1.3. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite para usar no dia seguinte.
2. Escolha uma única colônia Listeria de uma cultura raia e inocular a 10 mL de caldo BHI. Evitar a transferência de agar para o caldo.
3. Incubar a cultura BHI Listeria em um agitador orbital a 180 rpm e 37 ° C ao meio-logarítmica fase (OD600 = ~ 0,4). Isso normalmente leva 3-4 horas.
4. Tomar uma alíquota de 0,9 mL assepticamente e obter uma leitura OD a 600 nm em 3-4 horas de agitação. Se a leitura é OD <0,3, então continuar a cultura em um agitador orbital a 180 rpm e 37 ° C até a leitura OD é de aproximadamente 0,4.
5. Adicionar 1 mL de glicerol estéril% 80 (v / v) a 10 mL Listeria cultura BHI caldo (OD600 ~ 0,4). Misture delicadamente e transferir para tubos de 1,5 mL em microcentrífuga alíquotas 0,5-1 mL.
6. Coloque as alíquotas em gelo por 10 min e armazenar a -70 ° C. Deixe uma alíquota descongelada para determinar a concentração de Listeria no estoque infecciosas, que é tipicamente na ordem de 10 ⁹ UFC / mL.
7. Realizar 01:10 diluições de série do unfroações Listeria zen infecciosas em PBS a 10 ^-8 de diluição. Spread de 100 L de não diluído e de cada diluição subseqüente em placas pré-secas HBA (passo 1.1) em duplicado, utilizando um espalhador de vidro. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
8. Contar o número de colônias em cada placa e determinar a concentração de Listeria da cultura estoque congelado infecciosas utilizando o seguinte cálculo: concentração (UFC / mL) = número de colônias x fator de diluição / 0,1 mL. As placas escolhido para contar devem, idealmente, ter 30-300 colônias para garantir uma estimativa fiável da concentração de UFC de bactérias viáveis.
9. Poucos dias depois de a armazenar existências infecciosas Listeria a -70 ° C, descongelar um tubo. Determinar a concentração de Listeria viável como descrito nos passos 2.7 e 2.8. Esta concentração deve ser semelhante à verificada para o estoque preparada infecciosas no passo 2.8.

Dicas e notas:

• Ações infecciosa listeria é congelado a uma glicerol percentual menor (8%) do que para Listeria congelado para armazenamento de longo prazo em geral (40%).
• Congelados Listeria ações infecciosas são geralmente estáveis ​​a -70 ° C por até 3 meses. Se usar mais de 3 meses, é recomendado que um novo material infeccioso ser preparados a partir de uma cultura fresca Listeria em uma placa HBA.
• Se a concentração do estoque descongelado Listeria infecciosas (passo 2.9) é diferente do estoque preparada conforme descrito nos passos 2.7 e 2.8 (ou seja, declínio> 20% em CFU), então um estoque congelado nova infecciosas devem estar preparados.
• Embora o tempo inicialmente consumir mais do que preparar um inóculo fresco bacteriana para uma experiência única, preparando congelados Listeria stocks infecciosos permite a determinação exata da concentração de UFC antes da infecção e melhor coerência entre experimentos, quando os camundongos são infectados a partir do mesmo material congelado.

3. Preparação de inóculo Listeria e injeção intravenosa de camundongos

1. Determinar a concentração de Listeria a ser injetado por mouse. Para injecção intravenosa, CFU em 200 mL de inóculo por mouse é usado.
2. Descongelar uma alíquota de ações infecciosas Listeria (a partir do Passo 2.6). Diluir o estoque infecciosas em PBS a concentração desejada CFU Listeria. O dobro do volume necessário para injetar todos os ratos para garantir que não é suficiente para injeção de inóculo e determinação da Listeria CFU pré e pós-injeção (passo 3.3 e 3.7).
3. Remover 2x 0,1 mL alíquotas do inóculo preparado Listeria, e preparar uma diluição de 1:10 em PBS para cada alíquota antes da injeção de camundongos. ML placa 0,1 de cada diluição em placas HBA, e incubar as placas durante a noite a 37 ° C. Contar o número de colônias e determinar a concentração de injeção de pré-inóculo da Listeria: concentração (UFC / mL) = (número de colônias x fator de diluição) / mL banhado por aquele fator de diluição.
4. Transferir o mouse para ser injetado em uma gaiola limpa. Quente o mouse, colocando a gaiola ~ 50 cm sob uma lâmpada de 250 watts de infravermelho por 5 min (outros adequados dispositivos térmicos que não vai queimar o mouse ou aumentar a temperatura da gaiola acima de 40 ° C também pode ser usado). Posicione o mouse em um dispositivo de retenção para injectáveis ​​veia da cauda.
5. Homogeneizar a suspensão Listeria para manter uma suspensão consistente cada vez que uma seringa é carregado.
6. Localizar a veia caudal lateral do mouse, limpe com um álcool 70% limpe e injetar 200 mL do inóculo de Listeria (na concentração desejada) usando uma seringa com uma agulha de calibre 27. Brevemente aplicar pressão sobre a ferida de entrada com uma gaze estéril. Devolver o mouse para sua gaiola.
7. Quando a injeção de todos os ratos é completado, repita o passo 3.3 usando o montante remanescente de inóculo para determinar a concentração pós-injeção do inóculo Listeria.
8. A quantidade de Listeria injetada em camundongos é relatado como o CFU média determinada a partir da pré-e pós-injeção de amostras de inóculo Listeria.

Dicas e notas:

• Normalmente, injetar 500 - 3000 UFC (200 mL de 2.500 UFC / mL - 15.000 UFC / mL de inóculo) quando se compara a carga bacteriana e respostas imunológicas entre uma cepa resistente do mouse (por exemplo, C57BL / 6) e uma cepa de rato suscetíveis (por exemplo, BALB / c ).
• Se o estoque infecciosas será diluído em PBS por pelo menos 10 ^5, em seguida, uma etapa de lavagem não é geralmente necessário para remover a mídia residual / glicerol. Se o estoque infecciosas não será diluído em PBS por pelo menos 10 ^5, em seguida, uma etapa de lavagem deve ser adicionado no passo 3.2 para remover a mídia residual / glicerol como segue: Add 9 mL PBS para descongelado ações infecciosas e bactérias coletadas por centrifugação a 2100 xg por 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender as células bacterianas peletizada em 10 mL estéreis PBS, centrifugação repetir, e ressuspender o pellet celular bacteriana no volume desejado. Determinar a média do UFC pré e pós-injeção de inóculo Listeria amostras conforme descrito na Etapa 3.3 e 3.7. Note-se que esta etapa de lavagem podem resultar em alguma perda de bactérias, e recomenda-se que tais perdas previamente determinadas e contabilizadas em fazer o inóculo de concentração necessária.
• Segurança descartar seringa e agulha após a injecção de mouse com Listeria.

4. Remoção do fígado e do baço de Listeria camundongos infectados para análise

1. Euthanase o mouse infectados no desejado tempo de infecção pós-ponto usando um método aprovado pelo Comitê de Ética em animais locais, como o CO ₂ asfixia.
2. Executar sangrar cardíaca imediatamente após a eutanásia, utilizando uma seringa de 1 mL e agulha de calibre 25. Coletar o sangue, tanto quanto possível. Remover da vesícula biliar e cortar a veia cava inferior.
3. Expor a veia portal hepática com cuidado empurrando os intestinos à direita, virar os lobos do fígado em direção à cabeça e à esquerda para que o fígado é estar onde o diafragma está localizado. A veia portal hepática alimenta no fundo do fígado do lado direito inferior.
4. Perfundir o fígado, injetando 10 mL PBS na veia portal hepática utilizando uma agulha de calibre 26. PBS injetada através da veia portal vai sair do decepada veia cava inferior. Perfusão de fígado assegura que as células são colhidas a partir do fígado e não o sangue circulante.
5. Retire o fígado perfundido da cavidade do mouse corpo, lugar em tampão FACS, e armazenar no gelo. Vá para o passo 5.1 para a preparação do fígado para análise FACS.
6. Remover o baço do mouse, coloque em tampão FACS, e armazenar no gelo.
7. Pesar o baço inteiro, cortado ao meio, e pesar uma das metades. Coloque metade um em tampão FACS e vá para o passo 6.1. Coloque a outra metade em um saco Stomacher no gelo e vá para o passo 7.1.

Dicas e notas:

• Nos passos 4.5 e 4.6, use tampão FACS suficiente para submergir completamente o tecido para minimizar a exposição de qualquer parte do tecido para o ar.
• A ½ polegada de comprimento agulha de calibre 26, que é dobrada por ~ 30 graus pode facilitar uma melhor injeção de PBS para a veia portal hepática.
• Quando perfundidos adequadamente, o fígado passa de uma cor vermelho escuro ao castanho claro depois de injetar 1-2 ml de PBS.
• Se o fígado não é necessária para a análise FACS, a perfusão não é necessária. O fígado pode ser isolados e coletadas diretamente em um saco Stomacher e processadas como descrito no passo 7.
• Para a eutanásia dos ratos, CO ₂ asfixia é o método preferido porque tem um impacto mínimo no UFC bacterianas e viabilidade das células imunes no baço e no fígado. Se a coleta de sangue não é necessário, deslocamento cervical pode ser usada como método de eutanásia alternativa. Recomenda-se que não métodos de eutanásia que podem afetar o peso de órgãos ou a viabilidade das células imunológicas ser utilizado (thiobarbiturates, por exemplo).

5. Preparação de suspensão de células hepáticas para análise FACS

1. Gerar uma única célula suspensões colocando fígado com FACS buffer (passo 4.5) em um filtro de células 70 mM que está dentro de uma placa de Petri 60 mm. Empurrar o tecido através do filtro da célula usando o êmbolo de uma seringa de 5 mL até obter uma suspensão de uma única célula é formada.
2. Transfira a hepáticas suspensão de uma única célula da placa de Petri para um tubo de 50 mL tampa de rosca cônica e trazer o volume total de 40 mL com tampão FACS frio.
3. Vortex suspensão celular e tirar uma alíquota de 1 mL para determinar a carga bacteriana para o fígado. Vá para o passo 7.3 e use esta alíquota de 1 mL, em lugar de homogeneizado de tecido em saco Stomacher.
4. Pellet células por centrifugação a 500 xg por 5 min a 4 ° C, elimine o sobrenadante, ressuspender pellet em 40 mL tampão FACS frio, agregar as células por centrifugação a 500 xg por 5min a 4 ° C, e descartar o sobrenadante.
5. Ressuspender o pellet celular em 20 mL de Percoll isotônica em temperatura ambiente. Centrífuga suspensão de células a 700 xg por 12 min em temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e folha de disco-como de células flutuando em cima (ou seja hepatócitos). Ressuspender o pellet de leucócitos contendo em 4 mL de buffer TAC para lisar eritrócitos e células incubar a temperatura ambiente por até 10 min com inversão freqüentes.
6. Suspensão de células do filtro através de uma membrana de nylon 100 mm em um novo tubo de centrífuga de 10 mL.
7. Underlay filtrada suspensão celular com 1 mL de buffer FCS / EDTA. Centrifugar a 350 xg para5 min a 4 ° C, elimine o sobrenadante e ressuspender em 5 mL tampão FACS / EDTA.
8. Centrífuga suspensão de células em 350 xg por 5 min a 4 ° C, elimine o sobrenadante e ressuspender celular em 0,5-3 mL tampão FACS / EDTA, dependendo do tamanho do sedimento.
9. Diluir 1:05-1:20 célula suspensão em azul de tripano, dependendo do volume de suspensão no passo 5.8. Contagem de leucócitos hepática viável usando hemocitômetro (Figura 4A) e determinar total de células viáveis ​​da seguinte forma: células viáveis ​​/ órgão = número de células na contagem fator de diluição x área x 10 ⁴ x volume (mL). Fígado de uma única célula suspensões podem ser marcadas com anticorpos específicos para desejar marcadores da superfície celular e analisados ​​por FACS.

Dicas e notas:

• Manter as células no gelo salvo indicação em contrário.

6. Preparação da suspensão de uma única célula do baço para análise FACS

1. Gerar uma única célula suspensões, colocando metade do baço (passo 4.7) com tampão FACS em um filtro de células 70 mM que está dentro de uma placa de Petri 60 mm. Empurre suavemente o tecido através do filtro da célula usando o êmbolo de uma seringa de 5 mL até obter uma suspensão de uma única célula é formada.
2. Transferência do baço suspensão de uma única célula da placa de Petri para um tubo de centrífuga de 10 mL e trazer o volume total de 10 mL com tampão FACS frio.
3. Pellet células por centrifugação a 350 xg por 5 min a 4 ° C, elimine o sobrenadante, ressuspender pellet celular em 4 mL de buffer TAC para lisar eritrócitos e células incubar a temperatura ambiente por até 10 min com inversão freqüentes.
4. Suspensão de células do filtro através de uma membrana de nylon 100 mm em um novo tubo de centrífuga de 10 mL.
5. Underlay filtrada suspensão celular com 1 mL de buffer FCS / EDTA. Centrifugar a 350 xg por 5 min a 4 ° C, elimine o sobrenadante e ressuspender pellet celular em 5 mL tampão FACS / EDTA.
6. Centrífuga suspensão de células em 350 xg por 5 min a 4 ° C, elimine o sobrenadante e ressuspender celular em 3-8 ml de tampão FACS / EDTA, dependendo do tamanho do sedimento.
7. Diluir 1:10 suspensão de células - 1:20 em azul de tripano (0,4% em água destilada), dependendo do volume de suspensão no passo 7.6. Contar esplenócitos viável usando hemacitómetro - veja o Passo 5.9 para o cálculo total de células viáveis ​​por órgão Spleen de uma única célula suspensões podem ser marcadas com anticorpos específicos para desejar marcadores da superfície celular e analisados ​​por FACS.

Dicas e notas:

1. Manter as células no gelo salvo indicação em contrário.

7. Medição da carga bacteriana em tecidos de camundongos infectados Listeria

1. Dobre a parte superior do saco Stomacher contendo a metade do baço. Enquanto segura o saco Stomacher fechada para evitar fugas, coloque-o deitado em um banco limpo ou em uma câmara de fluxo laminar. Rolar uma caneta grossa redonda sobre o tecido até que o tecido é purê de dentro do saco.
2. Adicionar 5 ml de PBS para cada saco Stomacher contendo tecido amassado. Coloque o saco Stomacher no Stomacher, e execute o Stomacher em alta velocidade por 10 minutos.
3. Misture o homogeneizado no saco Stomacher (ou a alíquota de 1 mL de suspensão de células hepáticas), com uma pipeta. Execute o seguinte em duplicatas. Transferência de 300 mL de uma placa de 96 poços de fundo plano. Dentro dos poços da placa de 96 poços realizar diluições em série 1:10 (30 mL em 270 mL PBS) a uma diluição 10 ^-5 para cada amostra de tecido homogeneizado.
4. Cuidadosamente distribuídos 0,1 mL de cada diluição em uma placa HBA pré-secagem usando um espalhador de vidro. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
5. Contar o número de CFU para cada diluição e calcular o UFC por tecido tendo em conta a parte do tecido (por exemplo, meia do baço a), o fator de diluição, e que o volume total de homogenato de tecido (5 mL ou 40 mL): UFC / tecido = CFU/0.1 mL x fator de diluição x mL / tecidos; para baço dividir esse número pelo peso percentual da amostra baço utilizado para homogeneização de tecido (veja o passo 4.7).

Dicas e observações:

• Mais do que um saco Stomacher pode ser colocado no Stomacher em um tempo tão longo quanto o volume total não ultrapasse o volume máximo, conforme especificado pelo fabricante
• Se um Stomacher não estiver disponível, um homogeneizador de tecido pode ser utilizado. Alternativamente, o método a seguir, embora não tão eficiente, também pode ser usado manualmente para macerar o órgão no lugar de passos 7.1 e 7.2: órgão lugar em um saco plástico selado e esterilizado deitado sobre uma bancada limpa, mantendo a bolsa fechada para evitar fugas . Rolo de 500 mL frasco de vidro de laboratório repetidamente sobre o saco até que o tecido é completamente amassada. Adicionar 5 mL de PBS a cada saco e vá para o passo 7.3.
• É muito importante no passo 7,4 que as placas HBA ser secados completamente(Ou seja, sem umidade sobre o ágar). Caso contrário, pode ser difícil obter distintas colônias Listeria que pode ser contado corretamente.
• Se houver placas HBA limitada, uma etapa alternativa 7.4 é: Desenhar linhas na parte inferior de uma placa HBA pré-secas (Passo 1.1) para dividi-lo em 5-6 seções, uma para cada diluição. Cuidadosamente pipeta 25 mL de cada diluição em seções correspondentes na placa HBA para cada homogenato de tecido - não se espalham com um espalhador. Espere até que gotas de homogeneizado de tecido estão secos antes de inverter a placa. Incubar placa a 37 ° C durante a noite. Até 80 colônias podem ser distinguidas devido a uma queda em uma placa de ágar.
• Diluição dos homogeneizados de tecido pode depender do crescimento da Listeria no animal e pode ser estimado com base nos sintomas apresentados pelo animal no momento da eutanásia. Para os ratos que são visivelmente moribundo, então diluições adicionais podem ser necessários para determinar com mais precisão a carga bacteriana. Para camundongos inoculados com doses baixas de Listeria ou camundongos sacrificados no final do período de infecção, homogeneizado de tecido não diluído pode ser usado para determinar a carga bacteriana.
• As placas podem ser incubados a 37 ° C durante a noite ou em temperatura ambiente por 2-3 dias.

8. Resultados representativos:

Para um experimento de infecção standard, Listeria foi obtido a partir de um estoque de glicerol congelados e semeado em uma placa HBA como mostrado na Figura 1. Se poucas colônias são obtidas após estrias, isso pode indicar estrias pobres ou menos do que o estoque congelado ideal. Um estoque de Listeria infeccioso foi preparado a partir de uma placa HBA recém listradas e armazenadas a -70 ° C. Para medir a depuração bacteriana e respostas imunológicas, que rotineiramente diluir o descongelamento de ações Listeria infecciosas a 2.500 UFC / mL - 15.000 UFC / mL e injetar camundongos com 200 mL para infectá-las com 500 - 3000 UFC. Observamos que camundongos infectados com doses sub-letais de Listeria usando este protocolo pode transitoriamente apresentam pele enrugada, postura arqueada e perda de peso dentro dos primeiros dias. Estes sintomas fornecer uma indicação visual de como severamente um mouse indivíduo é afetada pela infecção, seja ela responde de forma diferente para o resto do grupo (ou seja, um outlier "óbvia"), e se a eutanásia é necessária para evitar o sofrimento excessivo e morte iminente devido à infecção.

Nos resultados representados pelas Figuras 2-5, camundongos foram infectados com uma alíquota de recém-descongelado de ações infecciosas Listeria. Em momentos diferentes pós-infecção, os camundongos foram sacrificados eo fígado e baço foram removidos. A Figura 2 mostra uma placa HBA em que homogeneizado baço diluída a partir de um único rato foi cultivado. Deve haver uma clara redução no número de colônias como o fator de diluição se torna maior, de tal forma que a contagem de UFC distintas é possível pelo menos duas diluições. Se o mouse limpou a infecção por Listeria (ou seja, limite de detecção = 100 UFC / tecido), então <5 colônias Listeria estará presente na placa HBA que foi espalhada com 200 mL de homogeneizado de tecido não diluído. Se o fígado e / ou baço contaminados com bactérias intestinais ou outros externos durante o isolamento, as colônias na placa HBA é provável que apresentam morfologia diferente (ou seja, não terá de halo característico e cor pálida de colônias de Listeria) e / ou pode ser diferentes na contagem de colônias para o que é esperado para Listeria (ou seja, poucos ou muitos). A Figura 3 mostra uma curva típica de apuramento para Listeria camundongos C57BL / 6 - nota que Listeria são tipicamente apuradas mais rapidamente do baço do que o fígado e que as operações não acontece até cinco dias após a infecção.

A Figura 4 mostra a contagem de células com base em uma única célula suspensões preparadas a partir de baço e fígado de camundongos infectados em diferentes momentos após a infecção. Este método pode alcançar> pureza de 95% dos leucócitos em uma única célula suspensões preparadas a partir de fígado e> 80% a partir de baço. Pureza de leucócitos pode ser determinada pela FACS análise utilizando um anticorpo monoclonal específico para o marcador pan-leucócitos CD45 (clone 30-F11). Normalmente, o número de leucócitos e esplenócitos hepática aumentar durante o período necessário para limpar a infecção com o fígado com maior aumento vezes em leucócitos hepática, mas um total substancialmente menor, em comparação com o aumento do baço no baço. O tipo eo número das células imunes pode ser determinada pela rotulagem das suspensões de uma única célula com anticorpos específicos para marcadores de superfície celular. Células marcadas podem então ser detectada por análise FACS. Figura 5 fornece resultados representativos para células T CD8 ^+. Durante uma infecção padrão monocytogenes em camundongos C57BL / 6, o número de células T CD8 ⁺ diminui transitoriamente devido à linfopenia no baço nos dias 03/02 before aumentar visivelmente a partir de dia 5 pós-infecção em ambos baço e fígado.

Figura 1. HBA placa estrias de Listeria. Um ciclo estéril foi usada para inocular raia Listeria a partir de um estoque de glicerol congelados. A placa foi incubada a 37 ° C durante a noite. O halo em torno característica colônias individuais é devido à β-hemólise.

Figura 2. Tecido homogeneizado de um camundongo Listeria infectadas cultivadas em placas HBA. Um fígado foi colhida a partir de um C57BL Listeria infectados / 6 do mouse em três dias pós-infecção. Homogenato de tecido foi preparado e colocado diluições de 100 mL prato cheio espalhou para 10 de diluição ^-4 (A) e 10 ^-5 diluição (B), bem como 25 gotas mL em uma placa HBA para cada diluição de 1:10 de não diluído a 10 ^-5 (C). As placas foram incubadas a 37 ° C durante a noite. As diluições que possibilitem a contagem de colônias individuais são usados ​​para determinar a carga bacteriana (ou seja, CFU / tecido) naquele momento pós-infecção.

Figura 3. Carga Listeria no baço e fígado de camundongos infectados C57BL / 6, 3 e 7 dias pós-infecção. Camundongos C57BL / 6 foram infectados com ~ CFU 2000 de Listeria. Em cada momento, os ratos foram sacrificados, o fígado foi perfundido e colhida com o baço e diluições de homogenato esplênica (A) ou hepática única célula-suspensão (B) foram cultivadas em placas HBA para determinar a carga bacteriana. Linhas sólidas indicam média geométrica, e as barras verticais indicam SEM. A linha pontilhada indica que o limite de detecção para medição precisa da carga bacteriana é de 100 UFC / órgão para este experimento.

Figura 4. Contagens de células viáveis ​​de tecidos de camundongos infectados. Camundongos C57BL / 6 foram infectados com ~ CFU 2000 de Listeria. Em cada momento, os ratos foram sacrificados, o fígado perfundido e colhida com o baço. As células foram coradas com azul de tripano e contou com um hemocitômetro conforme descrito na Etapa 5.9 (A). Esplenócitos (B) e hepática de leucócitos (C) contagens obtidas a partir de uma única célula suspensões preparadas a partir de Listeria camundongos infectados. Linhas indicam média geométrica.

Figura 5. FACS análise de células T CD8 ⁺ em camundongos infectados Listeria. Camundongos C57BL / 6 foram infectados com ~ CFU 2000 de Listeria. Em cada momento, os ratos foram sacrificados, o fígado perfundido e colhida com o baço. De uma única célula suspensões foram corados com anticorpos específicos para células T (CD3 TCRβ, CD4, CD8). (A) Representante perfis com FACS% CD8 ⁺ T células + / - SEM. (B) Total células T CD8 ⁺ no baço. (C) Total células T CD8 ⁺ no fígado.

Discussão

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Cavalo ágar sangue de base No.2	Oxoid	CM0271	Preparação de base de agar para placas HBA
Sangue de cavalo (desfibrinado)	Oxoid	HB1000	Adicionar 5-10% a base de agar
Infusão de cérebro coração (BHI) caldo (10 mL)	Oxoid	TM456
Cérebro media coração infusão desidratado	Oxoid	CM1135
De 96 poços da placa de fundo chato	BD Biosciences	353072
70 coador célula M	BD Biosciences	352350
Pequena placa de Petri	BD Biosciences	351007
Stomacher 80 Biomaster laboratório sistema	Seward
Sacos de plástico Stomacher	Sarstedt	86 9924 530
Albumina de soro bovino	Sigma	A3912
FACS tampão			0,1% (w / v) de soro albumina bovina em PBS
Isotônica Percoll (33,75% em Percoll PBS)	GE Healthcare	17-0891-01	33.75mL Percoll, 3.75mL PBS 10x, 62.5mL 1x PBS faz 100mL Percoll isotônica
TAC do buffer			Tris 17mm, cloreto de amônio 140mm em água destilada
FCS / EDTA			Soro fetal bovino com 10mM EDTA
FACS / EDTA			FACS tampão + EDTA 5mM
Azul de tripano	Sigma	T6146	0,4% (w / v) em PBS, esterilizado por filtração
2mL Cryovial	Greiner Bio One	121263
27 seringa de insulina gauge/1mL	Terumo Medical Products	SS10M2713
Agulha	Terumo Medical Products	NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Seringa	Terumo Medical Products	SS-01T (1mL), SS-053 (5ml), SS-10S (10 ml)