Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Özet

Listeria monocytogenes farelerde bağışıklık yanıtlarını ve genetik yatkınlık bakterilerin hücre içi eğitim için bir model organizmadır. Bu yöntem, bakteri yükü ölçmek ve Listeria enfeksiyonu nedeniyle bağışıklık hücreleri değişiklikleri belirlemek için FACS analiz için farelerin karaciğer ve dalak tek hücre süspansiyonları oluşturmak için bir olanak sağlar.

Özet

Listeria monocytogenes (Listeria) Gram-pozitif fakültatif hücre içi bir patojen ^1. Fareler üzerinde yapılan çalışmalarda genellikle intravenöz enjeksiyon Listeria istihdam, sistemik enfeksiyon ² sonuçlanır. Enjeksiyondan sonra, Listeria CD8α ⁺ dendritik hücreleri ve Kupffer hücreleri ^3,4 alımı nedeniyle dalak ve karaciğer hızla yaymaktadır. Bir kez fagosite, çeşitli bakteriyel proteinler, phagosome kaçmak, sitoplazmada içinde hayatta ve komşu hücreleri ^enfekte 5 Listeria sağlar . Enfeksiyon ilk üç gün boyunca, farklı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri (örneğin monositler, nötrofil, NK hücreleri, dendritik hücreler) Listeria çoğalması en aza indirmek bakterisidal mekanizmalar aracılık. CD8 ⁺ T hücreleri, daha sonra işe ve nihai temizlenmesi için genellikle 10 gün ^enfeksiyonu 6 içinde ev sahibi, Listeria sorumludur .

Başarılı klerensi enfekte olmuş fareler Listeria konağın immün yanıtları ⁶ uygun başlangıçlı bağlıdır. Kendilenmiş fare suşlarının ^7,8 arasından geniş bir hassasiyetleri vardır. Genellikle, Listeria enfeksiyonuna yatkınlığı olan farelerin daha az dayanıklı farelere kıyasla artmış bakteri yükü ve / veya gecikmiş boşluk gösteren bakteri çoğalması kontrol edebiliyoruz . Bağlantı analizleri ve nakavt fare suşları da dahil olmak üzere genetik çalışmalar, çeşitli gen dizisi ^varyasyon Listeria enfeksiyonu 6,8-14 ev sahipliği yanıtları etkiler var. Bu nedenle, farklı fare suşları arasında enfeksiyon kinetiği belirlenmesi ve karşılaştırılması Listeria karşı bağışıklık yanıtlarını katkıda konak genetik faktörlerin belirlenmesi için önemli bir yöntemdir. Konakçı tepkileri farklı Listeria suşlarının karşılaştırılması da antibiyotik tedavisi ya da aşısı tasarımı için potansiyel hedefler olarak hizmet verebilir bakteriyel virülans faktörleri tanımlamak için etkili bir yoldur .

Biz burada bakteri yükü (koloni oluşturan birim [CFU] başına doku) ölçme ve Listeria ile enfekte farelerde bağışıklık yanıtları FACS analizi için karaciğer ve dalak tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem ilk romanı fare suşlar Listeria enfeksiyonu karakterizasyonu, yanı sıra bağışıklık yanıtlarını, Listeria ile enfekte olan farklı fare suşları arasında karşılaştırma için özellikle yararlıdır . Biz, kan agar kültür, β-hemoliz ¹ (Şekil 1) nedeniyle her koloninin çevresinde karakteristik bir hale bölge sergiler suşu ¹⁵ EGD Listeria monocytogenes kullanın. Bakteriyel yük ve bağışıklık yanıtlarını aşağıda açıklanan protokolleri kullanarak FACS analizi için kan agar plakalarını ve doku hücre süspansiyonlarının hazırlanması kültür dokusu Homojenat enfeksiyonu sonra herhangi bir zaman noktasında tespit edilebilir. Biz, immün sistemi baskılanmış veya hamile bireyler Listeria işlemez gerektiğine dikkat cekti ve ilgili kurumsal biyogüvenlik komitesi ve hayvan tesis yönetimi, işe başlanmadan önce danışılmalıdır .

Protokol

1. Listeria monocytogenes kültür ve uzun vadeli depolama (Listeria)

1. Önceden yapılmış at kanlı agar (HBA) plakaları olun ya da satın alabilirsiniz. Kuru plakalar ön kuluçka önce 37 ° C gece veya 1 saat için bir laminer akış kabini ortaya yerleştirmek.
2. Virüslü bir fare doku homojenatında, liyofilize stok, donmuş bir gliserol stoku, ya da, yeni bir Listeria kültür (10'dan fazla alt-kültürlü nesiller eski bir hafta daha az değil yani) bir koloni: Aşağıdaki yaşayabilir Listeria edinin . Tüm Listeria steril bir aşılama döngü kullanarak ve bu protokolü açıklanan tüm yöntemleri aseptik teknikler istihdam alınmalıdır.
3. Primer inokulum yayılmasını olarak levha yüzeyinin ¼ Listeria çizgi gibi steril bir aşılama döngü kullanarak Şekil 1'de gösterildiği gibi bir HBA plaka Listeria Streak. Birincil yayılmış, tek yönlü çizgiler bir dizi olun. Şeritli çizgiler her ayarlamadan önce taze veya yeniden sterilize bir döngü kullanarak 2-3 kez tekrarlayın. ° C gecede 37 plakalar inkübe edin.
4. 1 aylık bir süre için 4 ° C Listeria HBA plaka Store ya da uzun süreli depolama için Listeria kültür hazırlamak için 1.5 adıma geçin.
5. Taze bir Listeria kültürü, steril bir aşılama döngü kullanarak bir HBA plaka üzerinde tek bir koloni seçin ve 10 ml 30 ml McCartney şişe beyin kalp infüzyon (BHI) suyu (üreticinin talimatlarına göre hazırlamak) aşılamak .
6. 37 ° C gecede 180 rpm'e ulaşan orbital çalkalayıcı Listeria kültür inkübe edin.
7. % 40 final gliserol konsantrasyonu (v / v) elde etmek için, 1:1 oranında sıvı Listeria kültür steril% 80 gliserol (v / v) ekleyin . 0.5-1 mL alikotları cryovials içine aktarın ve Listeria / gliserol stokları saklamak -70 ° C

İpuçları ve notlar:

• Listeria Büyüme kanlı agar (at, koyun, kobay veya insan kanı ile desteklenmiş), beyin kalp infüzyon agar veya et suyu (BHI), veya maya ile triptik soy broth gibi farklı non-selektif medya, destek olabilir (TSB-YE) ayıklayın. Kirletilmesi büyüme tanımlanan antibiyotik direnci (örneğin, L. monocytogenes 10403S) Listeria suşları için medya için antibiyotik ekleyerek veya seçici Listeria büyümeyi desteklemek Oxford medya, kullanarak kültür minimize edilebilir.
• Listeria sınanmamış bir kaynaktan elde edilirse, kimliğini teyit etmek için ek testler yapılması önerilir Listeria (L. monocytogenes Gram pozitif, spor oluşturmayan, hareketli <30 ° C, fakültatif anaerobik, katalaz pozitif ve oksidaz negatif). Elde kültürü de Listeria seçici besiyerleri saf kültür elde edilir olmasını sağlamak için yetiştirilen olabilir.
• HBA plakaları Kurutma plaka üzerinde bakteri kolonilerinin en iyi şekilde ayrılması olduğunu garanti eder.
• Listeria dondurulmuş gliserol stokları yaparken, mümkün olduğunca birkaç nesil (<5 en iyi) için en az 1 hafta eski ve alt-kültür taze HBA Listeria kültürler kullanın .
• Listeria dondurulmuş gliserol stokları elde nedeniyle taze donmuş bir gliserol stoku Listeria kültürler kaynaklanan zaman, ilk geçiş doğrudan sıvı besiyerinde pasajlandı zaman kötü büyümeye katı ortamda (yani HBA plakaları) olmalıdır.

2. In vivo enfeksiyon çalışmalar hazırlanması ve Listeria bulaşıcı stokunun depolama

1. HBA tabağa donmuş bir gliserol stoku (Adım 1.7) Listeria Streak adım 1.3 'de açıklandığı gibi. 37 ° plakaları ° C'de ertesi gün kullanılmak için bir gecede.
2. Bir çizgi kültürü tek bir Listeria koloni seçin ve 10 ml BHI suyu aşılamak. Suyu içine agar transfer kaçının.
3. Orbital çalkalayıcı Listeria BHI kültür inkübe 180 rpm ve 37 ° C orta-logaritmik faz (OD600 = ~ 0.4). Bu genellikle 3-4 saat sürer.
4. 0.9 mL kısım aseptik ve sarsıntının 3-4 saat 600 nm'de OD okuma almak. OD okuma <0.3 ise, 180 rpm ve 37 ° orbital çalkalayıcı kültür devam ° C OD okuma kadar ~ 0.4.
5. 1 ml steril% 80 gliserol (v / v) (OD600 ~ 0.4) 10 ml Listeria BHI broth kültürü ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 0.5-1 ml alikotları, 1.5 ml mikrofuge'de tüpler içine transfer.
6. -70, 10 dakika ve mağaza buz üzerinde alikot yerleştirin ° C 10 ⁹ CFU / mL amacıyla genellikle bulaşıcı stok Listeria konsantrasyonu belirlemek için donmamış bir kısım bırakın.
7. Unfro 01:10 seri dilüsyonları gerçekleştirinPBS içinde 10 ^-8 seyreltme zen Listeria bulaşıcı stok. 100 sulandırılmamış mcL ve sonraki her seyreltme yinelenen önceden kurutulmuş HBA levhalar (adım 1.1) üzerine bir bardak dağıtıcısı kullanarak sürün. ° C gecede 37 plakalar inkübe edin.
8. Her plaka üzerinde kolonilerin sayısını ve aşağıdaki hesaplama kullanarak dondurulmuş bulaşıcı stok kültür Listeria konsantrasyonunu belirlemek: konsantrasyon (CFU / ml) = kolonilerin sayısı x seyreltme faktörü / 0,1 ml. Sayım için seçilen plakalar ideal, güvenilir bir şekilde tahmin, canlı bakteri CFU konsantrasyonu sağlamak için 30-300 koloniler olmalıdır.
9. -70 Listeria bulaşıcı stok depolayarak birkaç gün sonra ° C, bir tüp dışarı çözülme. Adımları 2.7 ve 2.8 'de açıklandığı gibi yaşayabilir Listeria konsantrasyonunu belirlemek. Bu yoğunlaşma, adım 2.8 'de taze hazırlanmış bulaşıcı hisse senedi için belirlenen e benzer olmalıdır.

İpuçları ve notlar:

• Listeria bulaşıcı stoku, genel uzun vadeli depolama (% 40) için dondurulmuş Listeria için daha düşük bir yüzdesini gliserol (% 8) dondurulur .
• Dondurulmuş Listeria bulaşıcı stokları tipik olarak -70 ° C'de 3 aya kadar stabildir . 3 aydan fazla kullanılması durumunda, yeni bir bulaşıcı stok HBA plaka üzerinde, taze Listeria kültürü hazırlanmış olması tavsiye edilir .
• (CFU yani>% 20 düşüş) adımları 2.7 ve 2.8 'de açıklandığı gibi taze hazırlanmış stok çözülmüş Listeria bulaşıcı stok konsantrasyonu (adım 2.9) farklı ise, o zaman yeni bir dondurulmuş bulaşıcı stok hazırlanmış olmalıdır.
• Başlangıçta tek bir deney için taze bir bakteriyel inokulum hazırlanması daha tüketen daha fazla zaman dondurulmuş Listeria bulaşıcı stoklarının hazırlanması, enfeksiyon ve fareler aynı donmuş stok enfekte deneyler arasında daha tutarlı önce CFU konsantrasyon doğru belirlenmesi sağlasa .

3. Listeria inokulum hazırlanması ve farelere enjeksiyonu

1. Listeria fare başına enjekte edilebilir konsantrasyon belirleyin. Intravenöz enjeksiyon için, içinde CFU fare başına 200 mcL inokulum kullanılır.
2. Listeria bulaşıcı stok donmuş bir kısım (Adım 2.6) Çözülme. İstenen Listeria CFU konsantrasyonu PBS içinde bulaşıcı stok sulandırınız. Enjeksiyonu ve kararlılık için inokulum yeterli olduğundan emin olmak için tüm farelere enjekte için gerekli hacim çift Listeria CFU pre-ve post-enjeksiyon (adım 3.3 ve 3.7).
3. Hazırlanan Listeria inokulum 0.1 mL alikotları 2x çıkarın ve farelerin enjeksiyon önce her bir kısım için PBS 1:10 seyreltme hazırlamak . Plaka HBA plakaları her seyreltme 0.1 ml ve 37 geceleme plakalar inkübe ° C Kolonilerin sayısını ve Listeria inokulum enjeksiyon öncesi konsantrasyonu belirler: konsantrasyon (CFU / ml) = (kolonilerin sayısı x seyreltme faktörü) / ml bu seyreltme faktörü kaplama.
4. Temiz bir kafes içine enjekte edilir fare aktarın. 5 dakika (fare ya da artış, 40 ° C de kullanılabilir yukarıda kafes sıcaklık yanmaz diğer uygun termal cihazlar) için 250 watt'lık bir infrared lamba ~ 50 cm altında kafes yerleştirerek fare ısıtın. Kuyruk ven enjeksiyonlar için frenleyici bir cihaz fare yerleştirin.
5. Bir şırınga yüklenen her zaman korumak için tutarlı bir süspansiyon Listeria süspansiyon hafifçe karıştırın.
6. Farenin lateral kuyruk ven bulun,% 70 etanol ile silin ve 27 gauge iğne ile bir şırınga kullanarak Listeria inokulum 200 mcL (istenilen konsantrasyonda) enjekte yavaşça silin. Kısaca giriş yara steril bir gazlı bez ile basınç uygulayın. Fare, kafese geri dön.
7. Tüm fareler enjeksiyonu tamamlandığında, adım 3.3 Listeria inokulum enjeksiyon sonrası konsantrasyonunu belirlemek için kalan miktar inokulum kullanarak tekrarlayın.
8. , Farelere Listeria enjekte edilen miktar, öncesi ve sonrası enjeksiyon Listeria inokulum örnekleri tespit ortalama CFU olarak bildirilir.

İpuçları ve notlar:

• Biz genellikle enjekte 500 - 3.000 CFU (2500 200 mcL CFU / ml - 15.000 CFU / ml inokulum), dirençli bir fare türünün (örneğin C57BL / 6) ve duyarlı bir fare türünün (örneğin, BALB / c arasında bakteri yükü ve bağışıklık yanıtlarını karşılaştıran .)
• Bulaşıcı hisse en az 10 ⁵ PBS içinde seyreltilmesi durumunda, daha sonra yıkama adımlı genellikle kalıntı medya / gliserol kaldırmak için gerekli değildir. Bulaşıcı hisse en az 10 ⁵ PBS içinde seyreltilmesi durumunda, daha sonra yıkama adımlı aşağıdaki gibi artık medya / gliserol kaldırmak için adım 3.2 'de eklenmiş olmalıdır: bir4 10 dakika 2100 xg'de santrifüj tarafından toplanan çözülmüş bulaşıcı stok ve bakteriler için dd 9 ml PBS ° C Süpernatantı ve 10 ml steril PBS, tekrar santrifüj pelet bakteri hücreleri tekrar süspansiyon ve istenilen hacmi bakteri hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Adım 3.3 ve 3.7 'de açıklandığı gibi öncesi ve sonrası enjeksiyon Listeria inokulum örnekleri ortalama CFU belirleyin . Bu yıkama adım bakterilerin bazı kaybına neden olabileceğini kaydetti ve böyle bir kayıp önceden belirlenmiş olması önerilir ve gerekli konsantrasyon inokulum oluşturuyor.
• Güvenle fare Listeria bakterisi enjekte sonra şırınga ve iğne atın.

4. Analiz için Listeria ile enfekte farelerde karaciğer ve dalak çıkarılması

1. CO ₂ boğulma gibi yerel Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış bir yöntem kullanarak istediğiniz zaman noktası sonrası enfeksiyon enfekte fare Euthanase.
2. 1 ml şırınga ve 25 gauge iğne kullanılarak ötenazi hemen sonra kalp kanama gerçekleştirin. Mümkün olduğunca çok kan toplayın. Safra kesesi çıkarın ve inferior vena kava sever.
3. Kafası doğru ve karaciğer, diyaframın nerede oturuyor şekilde sol karaciğer loblar, çevirin, bağırsak dikkatle sağa iterek hepatik portal ven Açığa. Hepatik portal ven sağ alt tarafta karaciğer dibine beslenir.
4. Karaciğer, 26 gauge iğne kullanılarak hepatik portal ven içine 10 ml PBS enjekte edilerek serpmek. Portal ven yoluyla enjekte PBS kopmuş inferior vena kava çıkacaktır. Karaciğer perfüzyon hasat hücreleri karaciğer ve kan olmasını sağlar.
5. Farenin vücut boşluğuna, FACS tampon yer, ve buz üzerinde saklayın perfüze karaciğer çıkarın. FACS analizi için karaciğer hazırlanması için 5.1 adıma geçin.
6. Fare, FACS tamponda yer ve buz üzerinde mağaza dalak çıkarın.
7. Yarıya tüm dalak, tartılır ve yarısının bir tartmak. Bir FACS tampon yarım ve 6.1 adıma geçin. Diğer yarısı, buz üzerinde bir Stomacher torbaya koyun ve 7.1 adıma geçin.

İpuçları ve notlar:

• 4.5 ve 4.6 adımları, tamamen daldırın doku doku herhangi bir kısmının havaya maruz kalma en aza indirmek için yeterli FACS tampon kullanın.
• ~ 30 derece bükülmüş ½ inç uzunluğunda 26 gauge iğne daha iyi PBS hepatik portal ven içine enjeksiyon kolaylaştırabilir.
• Düzgün perfüze, karaciğer, açık kahverengi, 1-2 ml PBS enjekte sonra koyu kırmızı bir renk döner.
• Karaciğer FACS analizi için gerekli değilse, perfüzyon gerekli değildir. Karaciğer izole edilmiş ve doğrudan Stomacher torbaya toplanır ve 7. adımda açıklandığı gibi işlenmiş olabilir.
• , Dalak ve karaciğer bakteriyel CFU ve bağışıklık hücre canlılığı üzerine minimal etkisi vardır, çünkü fareler ötenazi _için, CO 2 boğulma tercih edilen bir yöntemdir. Kan toplama gerekli değilse, servikal dislokasyon alternatif ötenazi yöntemi olarak kullanılıyor olabilir. Bu organ ağırlık veya bağışıklık hücre canlılığını etkileyebilir ötenazi yöntemleri (örneğin thiobarbiturates) kullanılmamasını tavsiye edilir.

5. FACS analizi için karaciğer hücre süspansiyonu hazırlanması

1. 60 mm Petri kabı içinde 70 mikron hücre süzgecinden FACS tamponu (4.5 adım) ile karaciğer koyarak tek hücre süspansiyonları oluşturun. Tek hücreli bir süspansiyon oluşuncaya kadar 5 ml şırınga pistonu kullanarak hücre süzgecinden doku itin.
2. Petri kabı 50 ml konik vidalı kapaklı tüp hepatik tek hücre süspansiyonu aktarın ve soğuk FACS tamponu ile toplam hacmi 40 mL getirmek.
3. Vorteks hücre süspansiyonu ve karaciğer için bakteri yükü belirlemek için 1 ml kısım almak. 7.3 adım ve bu 1 ml kısım Stomacher çanta doku Homojenat yerine kullanmak için gidin.
4. 4 5 dakika için 500 xg ° C, santrifüj Pelet hücreleri tarafından 40 ml soğuk FACS tampon supernatant, tekrar süspansiyon pelet atın, pelet 4 5min için 500 xg'de santrifüj hücreleri tarafından ° C ve supernatant atın.
5. Oda sıcaklığında 20 ml izotonik Percoll hücre pelletini tekrar. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 700 xg'de santrifüjleyin. Supernatant ve disk gibi sac üstünde yüzen hücreler (yani hepatositler) atın. Sık inversiyon ile 10 dakika kadar oda sıcaklığında eritrositler ve inkübe hücreleri lyse 4 mL TAC tampon lökosit içeren pelletini tekrar.
6. Yeni bir 10 ml santrifüj tüp içine 100 mikron naylon zarından Filtre hücre süspansiyonu.
7. 1 ml FCS / EDTA tamponu ile Underlay hücre süspansiyonu filtre. 350 xg santrifüjleyin5 dakika 4 ° C, supernatant atmak ve 5 ml FACS / EDTA tampon tekrar süspansiyon haline getirin.
8. 4 hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 350 xg'de santrifüjleyin ° C, supernatant atmak ve pelet boyutuna bağlı olarak 0,5-3 ml FACS / EDTA tampon tekrar süspansiyon hücre pelletini.
9. Tripan mavi adım 5.8 süspansiyon hacmi bağlı olarak hücre süspansiyonu 1:05-01:20 seyreltilir. Hemasitometre kullanan canlı karaciğer lökosit (Şekil 4A) sayın ve toplam canlı hücreler aşağıdaki gibi belirler: canlı hücre / organ = sayma alanı x seyreltme faktörü hücre sayısı x 10 ⁴ x hacmi (ml). Karaciğer tek hücre süspansiyonları daha sonra istenilen hücre yüzey belirteçleri için özel antikorlar ile etiketlenir ve FACS analiz edilebilir.

İpuçları ve notlar:

• Aksi belirtilmediği sürece hücreleri buz üzerinde tutun.

6. FACS analizi için dalak tek hücre süspansiyonu hazırlanması

1. 60 mm Petri kabı içinde 70 mikron hücre süzgecinden FACS tamponu ile dalak bir yarısı (adım 4.7) yerleştirerek, tek-hücre süspansiyonları oluşturun. , Tek hücreli bir süspansiyon oluşuncaya kadar 5 ml şırınga pistonu kullanarak hücre süzgecinden doku hafifçe bastırın.
2. Dalak tek hücre süspansiyonu Petri kabı 10 ml santrifüj tüpüne aktarın ve toplam hacmi 10 ml soğuk FACS tampon kullanarak getirmek.
3. 4 5 dakika için 350 xg ° C, santrifüj Pelet hücreleri sık inversiyon ile 10 dakika kadar oda sıcaklığında eritrositler ve inkübe hücreleri lyse 4 mL TAC tampon supernatant, tekrar süspansiyon hücre pelletini atın.
4. Yeni bir 10 ml santrifüj tüp içine 100 mikron naylon zarından Filtre hücre süspansiyonu.
5. 1 ml FCS / EDTA tamponu ile Underlay hücre süspansiyonu filtre. 5 dakika 4 ° C için 350 xg'de santrifüj, supernatant atmak ve tekrar süspansiyon hücre pelletini 5 ml FACS / EDTA tampon.
6. 4 hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 350 xg'de santrifüjleyin ° C, supernatant atmak ve pelet boyutuna bağlı olarak 3-8 ml FACS / EDTA tampon tekrar süspansiyon hücre pelletini.
7. Sulandırınız hücre süspansiyonu 01:10 - tripan mavisi (distile su ile% 0,4) 01:20, adım 7.6 süspansiyon hacmine bağlı. Hemasitometre kullanarak canlı splenositlerin sayın sonra istenilen hücre yüzey belirteçleri için özel antikorlar ile FACS tarafından etiketlenir ve analiz edilebilir organı Dalak tek hücre süspansiyonları başına toplam canlı hücreleri hesaplamak için Adım 5.9.

İpuçları ve notlar:

1. Aksi belirtilmediği sürece hücreleri buz üzerinde tutun.

7. Listeria ile enfekte farelerde dokularda bakteri yükü ölçümü

1. Dalak yarısını içeren Stomacher çanta üst katlayın. Stomacher torba tutarak kaçağı önlemek için kapattı, temiz bir bankta ya da bir laminar flow kabin düz koymak. Doku çanta içinde püre kadar doku üzerinde kalın bir yuvarlak kalem döndürün.
2. 5 ml PBS püresi doku içeren her Stomacher torbasına ekleyin. Stomacher Stomacher torba içine koyun ve 10 dakika boyunca yüksek hızda Stomacher çalıştırın.
3. Stomacher torbası (ya da karaciğer hücre süspansiyonu 1 ml kısım) Homojenat bir pipet yardımıyla karıştırın. Çiftleri aşağıdaki gerçekleştirin. 96 sıra düz bir alt plakası 300 mcL aktarın. 96-plaka kuyu içinde her doku Homojenat örnek için 10 ^-5 seyreltme 1:10 seri dilüsyonları (270 mcL PBS içine 30 mcL) gerçekleştirin.
4. Dikkatlice cam bir dağıtıcı ile bir ön kurutulmuş HBA plaka üzerine 0.1 mL her seyreltme yayıldı. ° C gecede 37 plakalar inkübe edin.
5. Her bir seyreltme için CFU sayısını ve doku kısmı (örneğin yarım dalak), seyreltme faktörü ve doku Homojenat toplam hacmi (5 ml veya 40 ml) dikkate alarak, başına doku CFU hesaplayın: CFU / doku = CFU/0.1 ml x seyreltme faktörü x mL / doku, dalak doku homojenizasyon için kullanılan dalak örnek yüzdesi ağırlığı (adım 4.7 'ye bakın) bu sayı bölün.

İpuçları ve notlar:

• Birden fazla Stomacher çanta, üretici tarafından belirtilen maksimum ses aşmadığı toplam hacmi gibi uzun bir zaman Stomacher yerleştirilir.
• Stomacher mevcut değilse, bir doku Homojenizatör yerine kullanılabilir. Alternatif olarak, aşağıdaki yöntemi kadar etkili olmasa da, 7.1 ve 7.2 adımları yerine elle organ ıslatarak yumuşatmak için kullanılan olabilir: steril kapalı bir plastik torba içinde yer organ ve kaçağını önlemek için kapatmaya torba tutarak temiz bir bank üzerinde yatıyordu . Yastığının üzerine doku iyice püre haline gelene kadar arka arkaya 500 mL laboratuvar cam şişe döndürün. 5 ml PBS ekleyin ve her torbaya 7.3 adıma geçin.
• HBA plakaları iyice kurulanmalıdır adım 7.4 'de çok önemlidir.(Yani Agar üzerinde herhangi bir nem). Aksi takdirde doğru sayılabilir farklı Listeria kolonileri elde etmek zor olabilir.
• Sınırlı HBA plakaları varsa, alternatif bir adım 7.4: 05:55 bölümleri, her biri bir seyreltme için içine bölmek için önceden kurutulmuş HBA plaka (Adım 1.1) alt çizgiler çizin. Dikkatle pipet ilgili bölüme, her doku homojenatında için HBA plaka üzerinde her seyreltme 25 mcL bir dağıtıcı ile yayılır yok. Doku Homojenat damlaları tersini plaka önce kuruyana kadar bekleyin. ° C gecede 37 plaka inkübe edin. 80 koloniler agar plaka üzerine bir damla nedeniyle ayırt edilebilir.
• Seyreltme doku homojenatlarının hayvan Listeria büyüme bağlıdır ve ötenazi zamanda hayvan tarafından görüntülenen belirtileri dayalı tahmin edilebilir. Farkedilir can çekişmekte olan farelerde, sonra ek dilüsyonları bakteri yükü daha doğru bir şekilde belirlemek için gerekli olabilir. Listeria ve enfeksiyon döneminin sonunda itlaf farelerde düşük doz ile aşılanmış farelerde, sulandırılmamış doku Homojenat bakteri yükü belirlemek için kullanılıyor olabilir.
• Plakalar 37 ° C'de inkübe edilebilir bir gecede ya da oda sıcaklığında 2-3 gün.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Standart bir enfeksiyon deneme için, Listeria, donmuş bir gliserol stok elde edilmiştir ve Şekil 1'de gösterildiği gibi bir HBA plaka üzerinde çizgili . Bulaşması, sonra birkaç koloniler elde edilirse, bu kötü şeritli veya optimal dondurulmuş stok daha az gösterebilir. Listeria bulaşıcı stok taze çizgili HBA plaka hazırlanan ve -70 ° C'de saklanan Bakteriyel gümrükleme ve bağışıklık yanıtlarını ölçmek için rutin 2.500 CFU / mL çözülmüş Listeria bulaşıcı stok sulandırmak - 15.000 CFU / ml ve 500 ile enfekte 200 mcL farelere enjekte - 3.000 CFU. Biz bu protokolü kullanarak Listeria alt öldürücü doz ile enfekte fareler karıştırdı kürk, hunched duruş ve kilo kaybı ilk birkaç gün içinde geçici olarak gösterebilir gözlemliyoruz. Bu belirtiler bu grubun geri kalanı (yani bir "açık" uç) farklı yanıt verip, bireysel bir fare enfeksiyon tarafından nasıl etkilendiğini ciddi olarak görsel bir ipucu sağlar ve aşırı acı ve yaklaşan ölümü önlemek için ötenazi gerekli olmadığı enfeksiyon nedeniyle.

Rakamlar 2-5 tarafından temsil edilen sonuçlar, fareler Listeria bulaşıcı stok taze çözülmüş kısım kullanılarak yakalanmıştı. Enfeksiyon sonrası farklı zaman noktalarında, fare itlaf edildi ve karaciğer ve dalak çıkarıldı. Şekil 2, tek bir fare seyreltilmiş dalak Homojenat kültür olduğu bir HBA plaka gösterir. Seyreltme faktörü yüksek olur gibi, farklı CFU sayma, en az iki dilüsyonları için mümkün olduğu gibi kolonilerin sayısı belirgin bir azalma olmalıdır. Fare Listeria enfeksiyonu (yani algılama limiti = 100 CFU / doku) temizlenir varsa, <5 Listeria kolonileri sulandırılmamış doku Homojenat 200 mcL yayıldı HBA plaka üzerinde mevcut olacaktır. Karaciğer ve / veya dalak izolasyon sırasında bağırsak ya da diğer dış bakteri ile kontamine hale gelirse, HBA plaka üzerinde koloniler farklı morfoloji (yani karakteristik hale ve Listeria kolonileri soluk renk olmayacak) ve / veya olabilir sergilemek olasıdır beklenen ne koloni sayıları farklı Listeria (yani çok az ya da çok). Şekil 3 C57BL / 6 fareler için tipik bir Listeria boşluk eğrisi gösterir Listeria genellikle dalak, karaciğer daha daha hızlı bir şekilde temizlenir ve bu boşluk enfeksiyonu beş gün sonrasına kadar olmaz olduğunu unutmayın .

Şekil 4 bulaşmış farelerin dalak ve karaciğer enfeksiyonu sonrası farklı zaman noktalarında hazırlanan tek hücre süspansiyonları dayalı hücre sayıları gösterir. Bu yöntem, dalak, karaciğer ve>% 80 hazırlanan tek hücre süspansiyonları>% 95 lökosit saflık elde edebilirsiniz. Lökosit saflık pan-lökosit işaretleyici CD45 (klon 30-F11) için özel bir monoklonal antikor kullanarak FACS analizi ile tespit edilebilir. Tipik olarak, dalak ve karaciğer lökosit sayısı, dalak dalak artışı ile karşılaştırıldığında, karaciğer ile, karaciğer lökosit kat daha büyük bir artış sergileyen enfeksiyonu temizlemek için gereken dönemde artış, ama önemli ölçüde daha küçük bir toplam. Hücre yüzey belirteçleri için özel antikorlar ile tek hücre süspansiyonları etiketleme bağışıklık hücrelerinin tipi ve sayısı tespit edilebilir. Etiketli hücreler sonra FACS analizi ile tespit edilebilir. Şekil 5 CD8 ⁺ T hücreleri için temsilci sonuçlar sağlar. C57BL / 6 farelerde standart bir Listeria enfeksiyonu sırasında, CD8 ⁺ T hücrelerinin sayısını geçici olarak günde 2-3 befor dalak lenfopeni nedeniyle azalıre hem dalak ve karaciğer gün 5 enfeksiyon sonrası gözle görülür şekilde artmaktadır.

Şekil 1 HBA plaka Listeria çizgili. Steril bir aşılama döngü donmuş bir gliserol stok Listeria çizgi kullanıldı. Plaka ° C gecede 37 inkübe edildi. Bireysel kolonileri çevreleyen karakteristik hale beta-hemoliz nedeniyle.

Şekil 2. Doku HBA plakaları kültüre Listeria ile enfekte fare Homojenat. Karaciğer 3 gün sonrası enfeksiyon Listeria ile enfekte C57BL / 6 fare hasat edildi. Doku Homojenat her 1:10 seyreltme için hazırlanan ve 10 ^-4 dilüsyon (A) ve 10 ^-5 seyreltme (B) yayılmış ul 100 plaka yanı sıra bir HBA plaka üzerinde 25 ul damla olarak yerleştirilir dilüsyonları 10'a için seyreltilmemiş ^-5 (C). Plakalar ° C gecede 37 'de inkübe edildi. Bireysel kolonilerin sayımı sağlayan dilüsyonları o zaman noktası sonrası enfeksiyon bakteri yükü (yani CFU / doku) belirlemek için kullanılır.

Şekil 3 enfekte C57BL / 6, 3 farelerin ve 7 gün sonrası enfeksiyon, dalak ve karaciğer Listeria yük . C57BL / 6 fareler ~ 2.000 CFU Listeria ile enfekte edildi. Her zaman noktada, perfüze farelerin karaciğer ve dalak ile hasat edildi, itlaf, ve dalak Homojenat (A) veya hepatik tek hücre süspansiyonu (B) dilüsyonları bakteri yükü belirlemek için HBA plakaları kültüre edildi. Düz çizgiler, geometrik ortalama gösterir ve dikey çubuklar SEM göstermektedir. Noktalı çizgi bakteri yükünün doğru ölçümü için tespit sınırı bu deney için 100 CFU / organ olduğunu gösterir.

Şekil 4 enfekte farelerden alınan dokular için canlı hücre sayımı. C57BL / 6 fareler ~ 2.000 CFU Listeria ile enfekte edildi. Her zaman noktasında, fare, itlaf karaciğer perfüze ve dalak ile hasat edildi. Hücreler tripan mavisi ile boyandı ve Adım 5.9 (A) 'de açıklandığı gibi bir hemasitometre kullanarak sayıldı. Splenocyte (B) ve hepatik lökosit (C) Listeria ile enfekte farelerde hazırlanan tek hücre süspansiyonları elde sayar. Çizgiler geometrik ortalama göstermektedir.

Şekil 5 FACS analiz CD8 ⁺ T hücreleri Listeria-enfekte olmuş fareler. C57BL / 6 fareler ~ 2.000 CFU Listeria ile enfekte edildi. Her zaman noktasında, fare, itlaf karaciğer perfüze ve dalak ile hasat edildi. Tek hücre süspansiyonları için özel antikorlar T hücreleri (CD3, TCRβ, CD4, CD8) ile boyandı. (A) Temsilcisi FACS profilleri% CD8 ⁺ T hücreleri + / - SEM. Dalak (B) Toplam CD8 ⁺ T hücreleri. (C) Toplam karaciğer CD8 ⁺ T hücreleri.

Tartışmalar

Listeria is one of the most widely used organisms to characterize host immune responses to intracellular bacteria⁶. The protocol presented here enables one to measure bacterial load and immune cell responses within the same tissue of a given mouse. This dual measurement of a particular tissue for each infected mouse provides for more robust comparisons within and between mouse cohorts (either representing different mouse strains or time points post-infection). While Listeria infection by oral administration could also be used to study immune responses in mice, infection by intravenous injection is often used because: 1) it ensures rapid and effective delivery to the bloodstream; 2) it results in a synchronized and consistent systemic infection; and 3) the Mus species harbors a mutation in the gene encoding the E-cadherin receptor, which limits Listeria infection by oral administration (this mutation affects Listeria's ability to bind the mouse E-cadherin receptor and to efficiently cross the epithelial lining of the gastrointestinal tract)^16-18.

There are a few critical steps in this protocol. First, the Listeria inoculum stock should be generated from a fresh overnight HBA culture to ensure viability and virulence. Second, it is important to accurately determine the CFU concentration of the inoculum before and after injecting all mice to ensure that the CFU concentration does not differ greatly between the first and last mouse injected. Third, injection of Listeria into the tail vein must be consistent for all mice. Lastly, it is necessary to perfuse the liver to deplete non-resident leukocytes to ensure accurate measurement of immune cells within the liver and not leukocytes passing through in the peripheral blood. All of these steps, if not performed successfully, can result in unwanted variability for bacterial load and/or immune responses between individual mice infected with Listeria.

Two limitations of this protocol are the investigator's skill for infecting mice by intravenous injection and the detection of bacterial load in tissues. If one person is injecting a large number of mice, Listeria viability (i.e. CFU concentration) may reduce over time once the frozen inoculum is thawed (e.g. >2 hours between injecting first and last mouse). It is up to the investigator to determine how many mice she/he can inject before the inoculum is compromised. Another limitation of this method is that the Listeria load cannot be accurately measured below 100CFU/organ due to the relatively small amounts of cultured tissue homogenate (e.g. Figure 3 indicates that 100CFU/organ is the detection limit). To more accurately measure lower values for CFU/organ, a larger amount of the tissue homogenate can be cultured (up to 0.5mL per plate, multiple plates can be used) so a greater proportion of the tissue is sampled for detection of Listeria. If a Stomacher is not available, then alternative methods to homogenate the tissue, such as using a tissue homogenizer, can be used instead for steps 7.1-7.2. On a practical note, if space in the 37°C incubator is limited for culturing tissue samples from infected mice, then HBA culture plates can be incubated at room temperature for 2-3 days (the colonies will grow slower at room temperature). However, room temperature should not be used when growing cultures for preparation of frozen Listeria stocks.

This protocol provides a basic approach for characterizing Listeria infection in mice and can be used with other Listeria strains besides EGD. In addition to the liver and spleen, single-cell suspensions from lymph nodes can also be generated. In either instance, these single-cell suspensions can be used for a variety of analyses, including measuring immune cell subsets, and in vitro stimulation of sorted immune cells. Once the basic techniques are mastered this protocol can also be modified to isolate Listeria-specific T cells¹⁹, characterize dendritic cells²⁰, or perform immune cell depletion at certain time-points after infection^21,22 to more thoroughly characterize the immune response in mice infected with Listeria.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
At kanlı agar baz No.2	Oxoid	CM0271	HBA plakalar için agar tabanının hazırlanması
At kan (defibrine)	Oxoid	HB1000	Agar baz% 5-10
Beyin kalp infüzyonu (BHI) suyu (10 ml)	Oxoid	TM456
Beyin kalp infüzyon susuz medya	Oxoid	CM1135
96-düz alt plakası	BD Biosciences	353072
70 mikron hücre süzgecinden	BD Biosciences	352350
Küçük petri	BD Biosciences	351007
Stomacher 80 Biomaster laboratuarı sistemi	Seward
Plastik Stomacher çanta	Sarstedt	86 9924 530
Sığır serum albumini	Sigma	A3912
FACS tampon			% 0,1 (w / v) PBS içinde sığır serum albumin
İzotonik Percoll (33.75% Percoll PBS içinde)	GE Healthcare	17-0891-01	33.75mL Percoll 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS 100 ml izotonik Percoll yapar
TAC Tampon			17mm Tris, distile su ile 140 amonyum klorür
FCS / EDTA tampon			10mM EDTA ile fetal buzağı serumu
FACS / EDTA tampon			FACS tampon + 5mM EDTA
Tripan mavi	Sigma	T6146	PBS içinde% 0.4 (w / v), filtre steril
2mL Cryovial	Greiner Bio One	121263
27 gauge/1mL insülin enjektörü	Terumo Tıbbi Ürünler	SS10M2713
Iğne	Terumo Tıbbi Ürünler	NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26g 1/2in)
Şırınga	Terumo Tıbbi Ürünler	SS-01T (1 ml), SS-053 (5ml), SS-10S (10 ml)