CD4 + T - اللمفاويات التقاط باستخدام رقاقة ميكروفلويديك المتاح لفيروس نقص المناعة البشرية

Summary

Abstract

Protocol

1. تعد قناة ميكروفلويديك مع سطح CD4 ⁺ المضادة للbiotinlayted.
2. ضخ 10 مليلتر من الدم في العينة 5 مل / دقيقة في قناة ميكروفلويديك مع ضخ حقنة.
3. اخراج الدم في 20 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة مع برنامج تلفزيوني.
4. حقن محلول مخفف FACS lysing (مخفف إلى 10 ٪ من الأسهم مع حل PBS) في 5ul/min لمدة 15 دقيقة.
5. احتضان لمدة 15 دقيقة.
6. حقن CD3 الابتدائي ⁺ الحل الأضداد (مخفف إلى 10 ٪ من الأسهم مع حل PBS) في 5 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة.
7. احتضان لمدة 2 ساعة.
8. طرد قناة مع برنامج تلفزيوني في 5 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
9. ضخ 20 ٪ AF488 CD4 ⁺ الأضداد ، و 0.2 ٪ محلول المخزون دابي ، و 10 ٪ CD3 الثانوية في الضد ⁺ 5 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة في نفس الوقت.
10. احتضان لمدة 20 دقيقة.
11. طرد قناة مع برنامج تلفزيوني في 5 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
12. عدد الخلايا تحت المجهر الفلورسنت :
    1. أبيض (بصري) -- الأسود والأبيض : خلية والغبار
    2. الأشعة فوق البنفسجية (دابي) -- أزرق : الخلية فقط
    3. الأزرق (CD4 ⁺⁾ -- الأخضر : T - اللمفاويات والوحيدات
    4. الأخضر (CD3 ⁺⁾ -- الأحمر : T - اللمفاويات فقط

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS microchannel				Fabricated by SU-8 mold
Blood				Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution		BD Biosciences	349202	Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.