CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l'HIV

Riepilogo

Abstract

Protocollo

1. Preparare canale microfluidica con anti-CD4 ⁺ biotinlayted superficie.
2. Iniettare 10 ml di sangue campione a 5 ml / min nel canale di microfluidica con pompa a siringa.
3. Lavare il sangue a 20 ml / min per 20 min con PBS.
4. Iniettare una soluzione diluita di FACS lisante (diluito al 10% dalla soluzione madre con PBS) a 5ul/min per 15 minuti.
5. Incubare per 15 min.
6. Iniettare primario CD3 ⁺ soluzione di anticorpi (diluita al 10% dalla soluzione madre con PBS) a 5 ml / min per 20 min.
7. Incubare per 2 ore.
8. Scovare canale con PBS a 5 ml / min per 15 min.
9. Iniettare 20% AF488 CD4 ⁺ anticorpi, 0,2% soluzione stock DAPI, e il 10% CD3 ⁺ anticorpi secondari a 5 ml / min per 20 minuti, allo stesso tempo.
10. Incubare per 20 min.
11. Lavare il canale con PBS a 5 ml / min per 15 min.
12. Contare le cellule al microscopio a fluorescenza:
    1. Bianco (ottica) - Bianco e nero: cellulare e polvere
    2. UV (DAPI) - Blu: cell solo
    3. Blu (CD4 ⁺⁾ - Verde: T-linfociti e monociti
    4. Verde (CD3 ⁺⁾ - Rosso: T-linfociti solo

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS microchannel				Fabricated by SU-8 mold
Blood				Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution		BD Biosciences	349202	Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.