CD4 + T-Lenfosit Yakalama HIV için Disposable mikroakışkan Chip

Özet

Özet

Protokol

1. Mikroakışkan kanal anti-CD4 ⁺ biotinlayted yüzey hazırlayın.
2. 5 ml / dk 10 ml numune kan şırınga pompası ile mikroakışkan kanal içine enjekte edilir.
3. PBS ile 20 dakika için 20 ml / dak kan yıkayın.
4. 15 dakika için 5ul/min seyreltilmiş FACS parçalama solüsyonu (PBS ile stok solüsyonu% 10 sulandırılmış) enjekte edilir.
5. 15 dakika boyunca inkübe.
6. 5 ml / dk 20 dk birincil CD3 ⁺ antikor solüsyonu (PBS ile stok solüsyonu% 10 sulandırılmış) enjekte edilir.
7. 2 saat süreyle inkübe edin.
8. 5 ml / dk 15 dk PBS ile kanal yıkayın.
9. 5 ml / dk, aynı zamanda 20 dakika boyunca% 20 AF488 CD4 ⁺ antikor,% 0.2 DAPI stok solüsyonu,% 10 ikincil CD3 ⁺ antikor enjekte edilir.
10. 20 dakika boyunca inkübe.
11. 5 ml / dk 15 dk kanalı PBS ile yıkayın.
12. Floresan mikroskop altında hücrelerin sayısı:
    1. Beyaz (optik) - Siyah ve beyaz: hücre ve toz
    2. Yalnızca UV (DAPI) - Mavi: hücre
    3. Blue (CD4 ⁺⁾ - Yeşil: T-lenfosit ve monosit
    4. Sadece Yeşil (CD3 ⁺⁾ - Kırmızı: T-lenfosit

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS microchannel				Fabricated by SU-8 mold
Blood				Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution		BD Biosciences	349202	Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.