CD4 + T-лимфоцитов Захват Использование одноразовых микрофлюидный чип на ВИЧ

Резюме

Аннотация

протокол

1. Подготовка микрожидкостных каналов с анти-CD4 ⁺ biotinlayted поверхности.
2. Inject 10 мл образца крови в 5 мл / мин в микрожидкостных канал с шприцевой насос.
3. Промойте крови на 20 мл / мин в течение 20 мин с PBS.
4. Inject разбавленный FACS лизирующего раствора (разбавляют до 10% от исходного раствора с PBS) в 5ul/min течение 15 мин.
5. Инкубировать 15 мин.
6. Inject первичной CD3 ⁺ раствор антител (разбавляют до 10% от исходного раствора с PBS) в 5 мл / мин в течение 20 мин.
7. Инкубируйте в течение 2 часов.
8. Промойте канал PBS в 5 мл / мин в течение 15 мин.
9. Inject 20% AF488 CD4 ⁺ антитела, 0,2% DAPI маточного раствора, а 10% вторичных антител CD3 ⁺ в 5 мл / мин в течение 20 мин, в то же время.
10. Инкубируйте в течение 20 мин.
11. Промойте канал PBS в 5 мл / мин в течение 15 мин.
12. Граф клетки под флуоресцентным микроскопом:
    1. Белый (оптический) - Черно-белый: клетки и пыли
    2. УФ (DAPI) - Синий: только клеток
    3. Синий (CD4 ⁺⁾ - Зеленый: Т-лимфоцитов и моноцитов
    4. Зеленый (CD3 ⁺⁾ - Красный: Т-лимфоцитов только

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS microchannel				Fabricated by SU-8 mold
Blood				Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution		BD Biosciences	349202	Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.