في الجسم الحي التصوير المزدوج الركيزة Bioluminescent

Summary

نحن هنا وصف الطرق لبناء والتخيل وقياس ردود الفعل bioluminescent كل من اليراع والإنزيمات وسيفيراز renilla أعرب في خلايا سرطان الثدي النقيلي خلال نموها والانبثاث في الجسم الحي.

Abstract

لدينا فهم كيف ومتى عبور الثدي الخلايا السرطانية من الأورام الأولية التي أنشئت لمواقع المتنقل زاد بمعدل استثنائي منذ ظهور في الجسم الحي bioluminescent ^1-3 تقنيات التصوير. والواقع أن القدرة على تحديد مكان وقياس نمو الورم طوليا في فوج واحد من الحيوانات لاستكمال الدراسة في مقابل التضحية الفردية مجموعات من الحيوانات في أوقات محددة قد أحدثت ثورة مقايسة كيفية الباحثين التحقيق الثدي الانبثاث السرطان. للأسف، ومنهجيات التقييم الحالي يحول دون في الوقت الحقيقي من التغييرات الهامة التي ارشح في نظم الخلايا مما يشير كخلايا سرطان الثدي (ط) تتطور داخل الأورام الأولية، (الثاني) نشر في جميع أنحاء الجسم، و (ثالثا) تجديد أعماله البرامج التكاثري في مواقع من النقيلي الآفة. ومع ذلك، التطورات الأخيرة في مجال التصوير bioluminescent جعل من الممكن الآن لتحديد وقت واحد spatiotempor محددةآل التغيرات في التعبير الجيني بوصفها وظيفة من التنمية والتقدم الورم النقيلي من خلال استخدام المزدوج ردود الفعل التلألؤ الركيزة. للقيام بذلك، والباحثين عن الاستفادة الانزيمات الخفيف إنتاج اثنين وسيفيراز معزولة عن اليراع (Photinus البرالس) والبحر وطي (Renilla كلوية الشكل)، وكلاهما الرد على ركائز يستبعد بعضها بعضا التي سهلت في السابق على نطاق واسع الانتشار في استخدام المختبر في الخلية على أساس الجينات مراسل المقايسات ^4. نحن هنا تظهر فائدة في الجسم الحي من هذه الانزيمات اثنين من الممثلين أن أحد رد الفعل التلألؤ يمثل على وجه التحديد حجم وموقع الورم النامية، في حين أن التفاعل الثاني الانارة بمثابة وسيلة لتصور حالة تفعيل نظم محددة مما يشير خلال مراحل متميزة من الورم والانبثاث التنمية. وهكذا، فإن أهداف هذه الدراسة هي ذات شقين. أولا، سنقوم بشرح الخطوات اللازمة لبناء الخلية المزدوجة مراسل bioluminescent خطق، وكذلك تلك اللازمة لتسهيل استخدامها في وضع الرؤية والتنظيم الزمانية المكانية في التعبير الجيني خلال خطوات محددة من الشبكة النقيلي. باستخدام نموذج 4T1 ثانوي لورم خبيث من سرطان الثدي، وتبين لنا أن النشاط في الجسم الحي عنصر Smad الاصطناعية تجليد (SBE) انخفض بشكل كبير في المروج الانبثاث الرئة بالمقارنة مع قياس في أن الورم الرئيسي ^4-6. في الآونة الأخيرة، وقد تبين الثدي الانبثاث سرطان إلى أن ينظم تغييرات داخل المكروية الورم الرئيسي وسدى رد الفعل، بما في ذلك تلك التي تحدث في الخلايا الليفية والخلايا المناعية تسلل ^7-9. وبالتالي، فإن هدفنا الثاني هو للتدليل على فائدة مزدوجة تقنيات bioluminescent في رصد النمو وتوطين السكان من اثنين من خلية فريدة من نوعها داخل آوى حيوان واحد خلال نمو سرطان الثدي وورم خبيث.

Protocol

1. مستقرة التعبير عن وسيفيراز Renilla CMV يحركها

1. ترنسفكأيشن واختيار السكان نسيلي مستقرة هو الأسلوب المفضل للتعبير عن هذا وسيفيراز مراسل renilla. هذا النهج تعطي أكثر اتساقا وموحدة التعبير وسيفيراز renilla بعد إدخال لاحقة من بنيات إضافية مراسل الثانوية (مثل يراعة luciferase أو البروتينات الفلورية).
2. بالنقل الخلايا الخبيثة في المصالح مع وسيفيراز ناقلات التعبير renilla الترميز، مثل الرطوبة، أو آخر pcDNA3.1 البلازميد إيواء علامة اختيار.
3. بعد ترنسفكأيشن، ضع تحت transfectants تركيز المضادات الحيوية الأمثل لعدة أيام إلى أسابيع لتسهيل عزل المستعمرات الفردية، التي يتم عزل في وقت لاحق بشكل فردي وsubcultured.
4. حدد ≥ 10 فرد renilla وسيفيراز، معربا عن المستعمرات لرصد مدى التعبير renilla.
المستعمرات التعبير عن كميات كبيرة من وسيفيراز renilla ليحلل وظيفية لضمان أن يتم الاحتفاظ خصائص (ط) من نظرائهم المرضية في جسم المريض الوالدين، و (الثاني) القيم التعبير renilla لا تحيد أو تتغير مع مرور الوقت. هذه الخطوات هي ضرورية للغاية لتجنب عزل ودراسة المتغيرات نسيلي / المنحرفين، والتحقق من صحة التكامل السليم للبناء renilla في الجينوم.
5. مرة واحدة معزول transfectant مستقرة والتحقق، يمكن للمرء إزالة الضغط الانتقائي والتأكد من أن التعبير عن وسيفيراز renilla سوف تظل ثابتة على مدى أطوال طويلة من الزمن سواء في التجارب المختبرية والحية.

2. التعبير والاختيار، والتحقق من وظيفية اليراع محرض وسيفيراز المروج يحركها

1. Subclone المروج من الاهتمام إلى مراسل pGL4-وسيفيراز البلازميد إيواء علامة اختيار (على سبيل المثال، بورomycin) والتي تختلف عن تلك المستخدمة لتحديد renilla للتعبير مستقرة (على سبيل المثال، هيغروميسين).
2. بالنقل الخلايا الخبيثة كما هو الحال في الخطوة الأولى، ثم حدد بعد ذلك لسكان بولكلونل مستقرة من الخلايا وسيفيراز، معربا عن اليراع. لأن الموقع الذي يدمج التقرير جين في الجينوم يمكن أن تثير الآثار الخاطئة على التعبير والتنظيم، فمن المستحسن لتحديد بولكلونل للسكان من الخلايا وسيفيراز، معربا عن اليراع بدلا من السكان نسيلي لضمان أن الجينات مراسل (ط) التعبير أن يعكس بصورة أكثر دقة للجين في الخلايا الذاتية الأبوية، و (الثاني) وبلغ متوسط ​​آثار التكامل على التعبير الجيني وتقلص عدد السكان في جميع أنحاء الخلية غير المتجانسة.
3. ويشار هندسة الخلايا الخبيثة على حد سواء للتعبير عن ثابت renilla وluciferases اليراع على أنها مزدوجة الخلايا مراسل bioluminescent، أو الخلايا DBR.
4. باستخدام <التقليديةem> في خلية القاعدة في المختبر فحوصات الجينات مراسل وسيفيراز، تحقق من أن الخلايا DBR تنظيم اليراع التعبير وسيفيراز، إما سلبا أو إيجابا، على نحو متناسق مع تلك التي لوحظت في الخلايا الأبوية عابر مع هذه النواقل. وبالمثل، تأكد من أن لا ينظم CMV يحركها التعبير عن renilla من التحفيز خلية مختلفة أو ظروف العلاج.
5. للقيام بذلك، والثقافة الأبوية والخلايا DBR في 24 لوحات جيدة، ويبني استخدام الخلايا الأبوية عابر في وقت لاحق بالنقل المشترك مع الأصل CMV-renilla والمروج اليراع لتوليد خلايا DBR.
6. بعد ذلك، وعلاج DBR والخلايا الأبوية بالنقل مع عوامل أو وكلاء الدوائية المعروفة لتنظيم المروج من الفائدة، وبعد ذلك quantitate اليراع والتلألؤ renilla باستخدام أدوات الفحص المزدوج Promega وسيفيراز.

3. إنشاء 4T1 أورام الثدي الابتدائية

1. النقيلي خلايا سرطان الثدي 4T1 أنناكانت قد صممت لمسببات الأمراض إعادة جدت عدم القوارض براني للتعبير عن ثابت ووسيفيراز renilla CMV يحركها (CMV-pcDNA3.1-renilla وسيفيراز-الرطوبة) وSBE يحركها يراعة luciferase (pGL4.2-SBE-يراعة luciferase-بورو) كما الموصوفة أعلاه. مثلي engraftment هذه النتائج سرطان خلايا الثدي في تشكيل عفوية الانبثاث في المقام الأول في الرئتين.
2. لا ينبغي أن يسمح 4T1 الخلايا للوصول إلى التقاء خلال نشر التقليدية في 2-الأبعاد نظم زراعة الأنسجة، وينبغي passaged أنهم في اليوم السابق في التلقيح الجسم الحي.
3. يجب خلايا 4T1 يمكن فصلها بواسطة trypsinization، وغسلها جيدا في وسائل الإعلام النمو، وتضعف في PBS إلى تركيز من الخلايا ⁵ 2X10 / مل وتخزينها على الفور على الجليد.
4. يجب الإناث BALB / C الفئران (4-6 أسابيع من العمر) يكون تخدير مع جرعة تحريض 3٪ isoflurane والحفاظ تحت التخدير بجرعة من 1٪ isoflurane. إعداد موقع الحقن بواسطة ينظف مع70٪ ايزوبروبيل. باستخدام ملقط، فهم بلطف ورفع الثدي 4 منصة الأربية. بعناية، ضع إبرة قياس 27،5 الجانب شطبة وحتى تحقن الدهون لوحة الثديية مباشرة تحت الحلمة، مع رعاية خاصة لا تدفع الإبرة في تجويف البطن. الافراج عن الغدة وحقن ببطء 50 ميكرولتر من تعليق خلية ⁽⁴ خلايا 1x10) إلى منصة الدهون الثديية.

4. التصوير الأولي الانارة المزدوجة

1. مباشرة بعد engrafting الخلايا 4T1 على منصة الدهون الثدي في حين أن الفئران ومازالت تخدير، وضخ 100 ميكرولتر من Coelenterazine RediJect في الوريد الذيل الأفقي. هذا هو تركيز الركيزة المثلى الموصى بها من قبل البائع وأفضل السكوت من قبل الحيوانات.
2. ضع الماوس على الفور في مخروط الأنف isoflurane في التصوير IVIS-200 نظام والحصول على صورة دقيقة 0،5-1 الانارة. الكفاءة بين الحقن والحصول على الصور مهم جدا، وإشارةلوسيفيراز renilla انخفاض حادا ~ 30 ثانية بعد الحقن. ضع الماوس مرة أخرى إلى قفصه والسماح لها لاسترداد لساعة 1 ≥، والتي تضمن أن أي وسيفيراز renilla المتبقية إشارة قد تبدد وأن الفأر قد تعافى تماما من التخدير.
3. إدارة 150 ملغ / كغ من ملح البوتاسيوم D-IP عن طريق الحقن وسيفيرين والانتظار 5 دقائق. هذا هو تركيز الأمثل للD-وسيفيرين، التي تنص على إشارة مستقرة الانارة ل5-15 دقائق بعد الحقن حيز حيوانات الاختبار. تخدير باستخدام الماوس isoflourane واستبدالها في IVIS-200، مع الحرص على وضع الحيوانات في وضع مماثل للغاية بالنسبة للاستحواذ renilla الأصلي. فإن كثافة العام لهذا اليراع إشارة تعتمد على نشاط المروج المصالح، وعلى هذا النحو، وسيفيراز اليراع تصور النشاط قد تتطلب اكتساب مرات الموسعة.
4. باستخدام الصورة الحية البرمجيات IVIS ضبطه على وضع "الفوتونات"، ووضع valuوفاق لrenilla على حد سواء والاستحواذ اليراع كوسيلة لإنشاء خط الأساس نسب التلألؤ النسبي (RLR).

5. طولية الانارة التصوير

1. خلايا 4T1 هي شديدة العدوانية، بحيث تلقيح 1x10 ⁴ خلايا يؤدي عادة إلى تكوين ورم واضح في حدود 1 في الاسبوع، وإلى الفتك من الحيوان داخل 4-5 أسابيع. الأورام 4T1 لها تتقرح الميل المتأصل في الأسبوع 4. قد النمو والحفاظ على الأورام المتقرحة تتطلب موافقة IACUC منفصلة. وقد تمت الموافقة على الدراسات أظهرت الورم 4T1 هنا من قبل IACUC في جامعة Case Western Reserve.
2. كما هو موضح أعلاه، ينبغي حقن الفئران أسبوعية مع Coelenterazine RediJect العامة لمراقبة نمو الورم والانبثاث، وكذلك مع D-وسيفيرين لرصد مسار إشارات محددة خلال مراحل مختلفة من التنمية الورم. والحرص على كل مرة لضمان إشارة renilla قد تبدد تماما وسيفيراز قبل اكتسابللإشارة وسيفيراز اليراع.
3. مثل الأورام 4T1 تطوير والتقدم، ينبغي تطبيع الاستحواذ وسيفيراز renilla إلى القيم الأولية renilla قياس وقت التلقيح الخلايا السرطانية كوسيلة لتطبيع الابتدائية وتتبع نمو الورم. الأهم من ذلك، سوف حساب القيم RLR مع مرور الوقت إنشاء تنظيم الزمني للفرد أنظمة الإشارات النسبية للنمو الورم والتقدم.
4. الانبثاث الرئة العلنية يصبح واضحا خلال 3-4 أسابيع بعد engraftment الخلية 4T1 على منصة الدهون الثديية. مقارنة القيم RLR الرئوي مقابل تلك المحسوبة للالورم الرئيسي يحدد التنظيم المكاني للفرد أنظمة الإشارات النسبية للنمو الورم والانبثاث.

6. Bioluminescent التصوير المزدوج من نوعين الخلايا الفريدة في حيوان واحد

1. مهندس سرطان الثدي سطر واحد ثابت الخلية إلى التعبير وسيفيراز renilla CMV يحركها كما هو موضح أعلاه. كرر هذههندسة العمليات باستخدام CMV يحركها يراعة luciferase على السطر الثاني الثدي الخلايا السرطانية المتميزة.
2. نحن هنا مختلطة renilla وسيفيراز، معربا عن الخلايا 4T1 مع nonmetastatic بهم ونظرائهم وسيفيراز إسوية الجينات، معربا عن اليراع 4T07 ^{10 و 11.} بعد ذلك يتم حقن نسب متفاوتة من هذه مختلطة السكان خلايا سرطان الثدي في لوحة الدهون الثدي كما هو موضح أعلاه.
3. الحصول على الفور على حد سواء اليراع والصور وسيفيراز renilla الأولية لإنشاء RLRs ممثل لخليط معين الخلية الملقحة.
4. سوف طولية التصوير المزدوج bioluminescent تصور وتتبع التغيرات في تكوين الخلايا خلال الورم الرئيسي، فضلا عن ورم خبيث الزمانية المكانية من كل ثدي سرطان مشتقة نسبة إلى نمو الورم والتقدم.
5. وبدلا من ذلك، يمكن تلقيح السكان الخلية الفردية سرطان الثدي في أماكن مختلفة في الماوس (أي البطن الثديية اليمين واليسار منصات الدهون)لتقييم التأثيرات الجهازية هذين الشعبين يحمل فوق بعضها البعض خلال مراحل مختلفة من نمو الورم والانبثاث.

7. ممثل النتائج:

A القوة الرئيسية في التصوير bioluminescent المزدوج يكمن في حقيقة أن كل صورة متناسقة داخليا وتسيطر عليها، مثل أن الإشارات المستمدة من استمرار وظيفة الورم الرئيسي كمقياس مهم لقياس نجاح أو فشل الشاملة لكل renilla واكتساب اليراع. هذا الجانب من التصوير الداخلي أهمية خاصة خلال عمليات الاستحواذ لنشاط وسيفيراز renilla الذي Coelenterazine الركيزة حساس جدا للأكسدة التي تنتج في قدرته على التألق الذاتي. الرقم 1A مثالا على هذا التأثير الجانبي، الذي يظهر على الفور كإشارات الانارة غير محددة مستمدة من الأمعاء، وليس الورم الراسخة الأولية. عادة، هذه Coelenterazine غير محدد يشير transpirفشل الحقن في الوريد ه التالية من هذه الركيزة وسيفيراز renilla. ومع ذلك، مرة واحدة قد تم الحصول عليها إشارات قوية الأولية renilla الورم المشتقة (1B الشكل والصورة إلى اليسار)، وأنها آمنة للمضي قدما في مسار التقاط إشارات قياسات محددة مستمدة من التصوير يراعة luciferase (1B الشكل، لوحة على اليمين)، الذي D-وسيفيرين الركيزة هو على درجة عالية من الاستقرار وحقن IP تنتج مستويات ضئيلة من خلفية لصناعة السيارات في التلألؤ.

الشكل 1. الحصول على renilla واليراع المستمدة من الصور bioluminescent لحساب RLRs في الجسم الحي. (A) مثال على فشل الحقن IV من Coelenterazine مما أدى إلى إشارة غير محددة من الأمعاء. وتشير دائرة PT الموقع التقريبي للالورم الرئيسي. (B) A الاستحواذ الناجح لrenilla الماوس تحمل الورم 4T1 الابتدائية وعulmonary الانبثاث (اللوحة اليسرى؛ 4wk بعد engraftment منصة الدهون). اقتناء اليراع المقابلة يسمح لحساب RLRs من ورم في المرحلتين الابتدائية والانبثاث في الرئة. (C) التمثيل البياني للورم الابتدائية وRLRs الانبثاث الرئة المحسوبة من الفئران هو مبين في لوحة B (ن = 4).

Discussion

السلطة المطلقة للتقنيات التصوير bioluminescent يكمن في قدرتها على قياس نمو الورم والانبثاث في الدراسات الطولية المعقدة، التي تنطوي على استخدام هذا القانون العدوانية 4T1 خلايا سرطان الثدي. لأن هذه الإجراءات تعتمد على التكامل مستقرة لكلا يبني مراسل وسيفيراز، يمكن تكييفها بسهولة هذه التقنيات وترجم إلى أخرى خطوط الخلايا السرطانية من الورم متفاوتة الإختفاء وقدرات النقيلي. مماثلة لنتائج تظهر هنا، وحساب RLRs محددة داخل تتطور ببطء الأورام الأولية والانبثاث في نهاية المطاف يسمح لتحديد الوقت الحقيقي الزمانية المكانية المحددة من الأحداث يشير إلى أن ارشح خلال التقدم المنتشر من الأورام بغض النظر عن مدتها من الكمون. على تحديد الأحداث المروج محددة التنظيمية، من المهم على حد سواء لاستئصال الورم الرئيسي والآفات النقيلي به لأداء المناعى القياسية وفارقتحليلات ل التعبير الجيني للتحقق من تنظيم مماثل للجين الذاتية و / أو البروتين.

من الناحية الفنية، فإن التحدي الرئيسي للتحليلات bioluminescent المزدوج يكمن في مدة قصيرة نسبيا من إشارات وسيفيراز renilla. على هذا النحو، وهذا يتطلب تقنية التصوير الأمثل كبيرة من حقن الوريد ذيل الإجراء، فضلا عن التصوير الفوري لحقن الحيوانات بشكل فردي، وهي عملية تستغرق وقتا طويلا وغير فعالة إلى حد ما بالنسبة لوسيفيراز اليراع التصوير. مؤخرا، قدم Promega "Viviren"، والتي تمثل الجيل الثاني وسيفيراز الركيزة التي من مواقع الأكسدة يتم حظرها من قبل الأسترة حتى هذا الجزيء في خلايا المكاسب دخول، وعند هذه النقطة هو جزيء بسرعة دي تجمعت. بشكل جماعي، وهذا يخفض بشكل فعال الركيزة رواية التعديل التلقائي التلألؤ وغير محددة و / أو تدهور بالإضافة إلى ¹² لصناعة السيارات في التلألؤ renilla التي يسببها. في القيام بذلك، وهذا renill جديدةركيزة وسيفيراز تنتج إشارات أكثر إشراقا الانارة، إلا أن التكاليف المفرطة المرتبطة اقتناء واستخدام "Viviren" لقد قدمت دراسات قليلة نسبيا اللازمة لتقييم فائدة العامة لهذا الركيزة في التحليلات bioluminescent المزدوج. وأخيرا، فإن أي حساسية الفحص bioluminescent يعتمد اعتمادا حاسما على كاميرا CCD فعال في الحصول على وحدات ضوء الفردية. في الواقع، وهذه التقنيات تحسين، ونحن نتوقع مرحلة ما في المستقبل حيث قدرتنا على تصور معقدة ضوء بوساطة التفاعلات bioluminescent قد ارشح بكفاءة في الحيوانات المتحركة مجانا ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
pGL4.2-بورو [luc2 / بورو] المتجهات	Promega	E6751
Glomax Mult-idection النظام	Promega
IVIS المجموعة 200	الفرجار العلوم الحياتية
الفحص المزدوج مراسل وسيفيراز النظام	Promega	E1960
Rediject coelenterazine-H	الفرجار العلوم الحياتية	760506
D-K وسيفيرين السلط	الفرجار العلوم الحياتية	122796