In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Riepilogo

Qui si descrivono i metodi per costruire, visualizzare e quantificare le reazioni bioluminescenti sia lucciola e Renilla enzimi luciferasi espressi in cellule metastatiche di cancro al seno durante la loro crescita e le metastasi In vivo.

Abstract

La nostra comprensione di come e quando il cancro al seno cellule di transito stabiliti tumori primari a siti metastatici è aumentato ad un ritmo eccezionale, in quanto l'avvento di in vivo bioluminescenti tecnologie di imaging ^1-3. Infatti, la possibilità di individuare e quantificare la crescita tumorale longitudinalmente in una singola coorte di animali a completamento dello studio rispetto a sacrificare singoli gruppi di animali in momenti specifici test ha rivoluzionato come i ricercatori indagare metastasi del cancro al seno. Purtroppo, le attuali metodologie esclude la valutazione in tempo reale dei cambiamenti critici che traspaiono in sistemi di segnalazione cellulare, come cellule di carcinoma mammario (i) evolvono all'interno tumori primari, (ii) la diffusione in tutto il corpo, e (iii) ricomincino programmi proliferative in siti di lesione metastatica. Tuttavia, i recenti progressi nel campo dell'imaging bioluminescente rendono ora possibile quantificare contemporaneamente spatiotempor specificoAl cambiamenti nell'espressione genica in funzione dello sviluppo e progressione tumorale metastatica mediante l'uso di due reazioni luminescenza substrato. Per farlo, i ricercatori approfittiamo per due enzimi che producono luce luciferasi isolati dalla lucciola (Fotino pyralis) e mare pansy (reniformis Renilla), entrambi i quali reagiscono a substrati si escludono a vicenda, che in precedenza facilitato il loro ampio utilizzo in cellula in vitro -saggi del gene reporter ^4. Qui mostriamo l'utilità in vivo di questi due enzimi tali che una reazione luminescenza segna specificamente le dimensioni e la posizione di un tumore sviluppo, mentre la seconda reazione luminescente serve come mezzo per visualizzare lo stato di attivazione di specifici sistemi di segnalazione durante fasi distinte di tumore e metastasi sviluppo. Pertanto, gli obiettivi di questo studio sono due volte. In primo luogo, verranno descritti i passi necessari per la costruzione di doppia bioluminescente linea cellulare giornalistas, oltre a quelle necessarie per facilitarne l'uso nel visualizzare la regolazione spazio-temporale dell'espressione genica durante fasi specifiche della cascata metastatica. Utilizzando il modello 4T1 di metastasi del cancro al seno, si dimostra che l'attività in vivo di un elemento sintetico Smad Binding (SBE) promotore è stato ridotto drasticamente in metastasi polmonari rispetto a quella misurata nel tumore primario ^4-6. Recentemente, metastasi tumore al seno ha dimostrato di essere regolata da cambiamenti all'interno del microambiente tumorale primaria e stroma reattivo, comprese quelle che si verificano in fibroblasti e cellule immunitarie infiltranti ^7-9. Così, il nostro secondo obiettivo sarà quello di dimostrare l'utilità della doppia tecniche bioluminescenti nel monitoraggio della crescita e la localizzazione di due popolazioni di cellule uniche nutriti all'interno di un singolo animale durante la crescita del cancro al seno e metastasi.

Protocollo

1. Espressione stabile di CMV-Driven Luciferase Renilla

1. Trasfezione e selezione di una popolazione stabile clonale è il metodo preferito per l'espressione di questo reporter Renilla luciferasi. Questo approccio derivano più coerente e uniforme espressione Renilla luciferasi dopo la successiva introduzione di ulteriori costrutti reporter secondarie (ad esempio, lucciola luciferasi o proteine ​​fluorescenti).
2. Trasfettare cellule maligne di interesse con la luciferasi espressione Renilla vettore di codifica, come pcDNA3.1-Hygro o un altro plasmide ospitare un marcatore selezionabile.
3. Seguendo trasfezione, posizionare i trasfettanti in una concentrazione di antibiotico ottimizzato per diversi giorni-a-settimana per facilitare l'isolamento di singole colonie, che vengono successivamente isolati individualmente e sottocoltura.
4. Selezionare ≥ 10 singoli Renilla luciferasi che esprimono colonie per monitorare il grado di espressione Renilla.
5. Colonie esprimono quantità elevate di Renilla luciferasi sono successivamente sottoposti ad analisi funzionale ad assicurare che i (i) caratteristiche fisiopatologiche della loro controparti parentali vengono mantenuti, e (ii) valori di espressione Renilla non deviare o cambiano nel tempo. Questi passaggi sono assolutamente essenziali per evitare di isolare e studiare le varianti clonali / devianti, e per convalidare una corretta integrazione del costrutto Renilla nel genoma.
6. Una volta che un trasfettante stabile è isolato e verificato, si può rimuovere la pressione selettiva ed essere certi che l'espressione della luciferasi Renilla resta costante per lunghi periodi di tempo sia in vitro che in vivo.

2. Espressione, selezione e verifica funzionale del promotore inducibile-Driven Firefly luciferasi

1. Subclonare il promotore di interesse in una PGL4-plasmide reporter luciferasi ospitare un marcatore selezionabile (ad esempio, puromycin) che è distinto da quello utilizzato per selezionare per l'espressione stabile Renilla (ad esempio, igromicina).
2. Trasfettare cellule maligne come al punto I, e successivamente selezionare per una popolazione stabile policlonale di lucciola luciferasi-cellule che esprimono. Dato che la posizione in cui un gene relazione integra nel genoma può suscitare effetti errate sulla sua espressione e la regolazione, si raccomanda vivamente di selezionare per le popolazioni policlonali di lucciola luciferasi-cellule che esprimono al contrario di popolazioni clonali per garantire che (i) l'espressione del gene reporter riflette più accuratamente quella del gene endogeno in cellule parentali, e (ii) effetti di integrazione su genica sono mediati e diminuita attraverso la popolazione cellulare eterogenea.
3. Le cellule maligne ingegnerizzate ad esprimere in modo stabile sia Renilla e luciferases lucciola sono indicate collettivamente come due cellule giornalista bioluminescenti, o cellule DBR.
4. Utilizzo in vitro saggi cellulari reporter gene luciferasi, verificare che le celle DBR regolare l'espressione di luciferasi di lucciola, positivamente o negativamente, in modo concorde con quella osservata in cellule parentali transitoriamente trasfettate con tali vettori. Allo stesso modo, verificare che CMV-driven espressione di Renilla non è regolata da stimoli cellulari diversi o condizioni di trattamento.
5. Per fare ciò, cultura DBR e cellule parentali in piastre da 24 pozzetti, e successivamente transientemente co-trasfettare cellule parentali con l'originale CMV-Renilla e promotore-lucciola costrutti usati per generare cellule DBR.
6. In seguito, trattare DBR e transfettate cellule parentali con fattori o agenti farmacologici noti per regolare il promotore di interesse, e successivamente quantificare lucciola e luminescenza Renilla utilizzando il Kit dual Luciferase Assay Promega.

3. Stabilire 4T1 tumori mammari primari

1. Metastatiche cellule di carcinoma mammario che 4T1ri trovato ad agenti patogeni roditori mancanza avventiziale sono stati progettati per esprimere stabilmente un CMV-driven luciferasi Renilla (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferasi-igrometrico) e un SBE-driven lucciola luciferasi (pGL4.2-SBE-lucciola luciferasi-puro) come descritto sopra. Attecchimento ortotopico di questi risultati cellule del cancro della mammella nella formazione di metastasi spontanee principalmente nei polmoni.
2. Cellule 4T1 non dovrebbe essere permesso di raggiungere la confluenza durante la loro propagazione nei sistemi di tessuti tradizionali a 2 dimensioni della cultura, e dovrebbero essere diversi passaggi il giorno prima del loro inoculazione in vivo.
3. Cellule 4T1 dovrebbe essere dissociate mediante tripsinizzazione, accuratamente lavati in terreni di coltura, e diluito in PBS ad una concentrazione di 2x10 ⁵ cellule / ml e immediatamente conservati in ghiaccio.
4. Femmina BALB / c (4-6 settimane) devono essere anestetizzati con una dose di induzione del 3% isoflurano e mantenuto sotto anestesia ad una dose di 1% isoflurano. Preparare il sito di iniezione con il tampone70% di alcol isopropilico. Utilizzando una pinza, afferrare e sollevare delicatamente il 4 pad inguinale mammaria. Con cautela, inserire un ago calibro 27,5 lato smussata e iniettare nel tappetino grasso mammario direttamente sotto il capezzolo, facendo attenzione a non spingere l'ago nella cavità addominale. Rilasciare la ghiandola e iniettare lentamente 50 ml di sospensione cellulare (1x10 ⁴ cellule) nel tampone grasso mammario.

4. Iniziale Imaging doppio luminescente

1. Immediatamente dopo l'attecchimento cellule 4T1 sul tampone grasso mammario e mentre i topi sono ancora anestetizzati, iniettare 100 pl di Coelenterazine RediJect nella vena caudale laterale. Questa è la concentrazione del substrato ottimale raccomandato dal fornitore e meglio tollerata dall'animale.
2. Porre immediatamente il mouse all'interno del cono naso isoflurano all'interno del sistema-200 IVIS immagini e acquisire un'immagine 0,5-1 minuti luminescente. Efficienza tra iniezione e acquisizione dell'immagine è molto importante, in quanto il segnaleper la luciferasi Renilla scende precipitosamente ~ 30 secondi dopo l'iniezione. Posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia e permettono di recuperare per ≥ 1 ora, che assicura che qualsiasi residuo di segnale luciferasi Renilla ha dissipato e che il mouse ha pienamente recuperato dalla anestesia.
3. Somministrare 150 mg / kg di D-luciferina sale di potassio mediante iniezione IP e attendere 5 minuti. Questa è la concentrazione ottimale di D-luciferina, che fornisce un segnale stabile luminescente per 5-15 minuti dopo l'iniezione in animali da esperimento. Anestetizzare il mouse usando isoflourane e sostituire nel IVIS-200, avendo cura di posizionare l'animale in una posizione molto simile, relative all'acquisizione originale Renilla. L'intensità complessiva di questo segnale lucciola dipenderà l'attività del promotore di interesse, e, come tale, visualizzando l'attività della luciferasi di lucciola possono richiedere lunghi tempi di acquisizione.
4. Utilizzando il software Living IVIS immagine impostata sulla modalità "fotoni", stabilire values sia per il Renilla e acquisizioni lucciola come mezzo per stabilire rapporti di luminescenza relativa linea di base (RLR).

5. Longitudinale luminescente Imaging

1. Cellule 4T1 sono molto aggressivi, in modo tale che l'inoculazione di 1x10 ⁴ cellule porta normalmente alla formazione del tumore palpabile entro 1 settimana, e alla letalità dell'animale entro 4-5 settimane. 4T1 tumori hanno una intrinseca propensione ulcerate nella settimana 4. La crescita e il mantenimento dei tumori ulcerati può richiedere a parte l'approvazione IACUC. Gli studi del tumore 4T1 indicate nel presente documento sono stati approvati dal IACUC presso la Case Western Reserve University.
2. Come descritto sopra, i topi deve essere iniettato settimanalmente con Coelenterazine RediJect per monitorare la crescita tumorale e metastasi generale, nonché con D-luciferina per monitorare pathway-specifici di segnalazione durante le varie fasi di sviluppo del tumore. Fare attenzione di volta in volta per garantire il segnale Renilla luciferasi è completamente dissipata prima dell'acquisizionedel segnale di luciferasi di lucciola.
3. Come tumori 4T1 sviluppare e progresso, acquisizioni Renilla luciferasi sono normalizzati ai valori iniziali Renilla misurate al momento della inoculazione delle cellule tumorali come mezzo per normalizzare e monitorare la crescita del tumore primario. Ancora più importante, del calcolo dei valori RLR nel tempo stabilirà la regolazione temporale dei singoli sistemi di segnalamento relativi alla crescita e progressione tumorale.
4. Overt metastasi polmonari si manifestano entro 3-4 settimane dopo l'attecchimento delle cellule 4T1 sul tampone grasso mammario. Confrontando i valori RLR polmonari rispetto a quelli calcolati per il tumore primario stabilisce la regolazione spaziale dei singoli sistemi di segnalamento relativi alla crescita tumorale e metastasi.

6. Doppio Imaging Bioluminescent di due tipi di cellule unici in un singolo animale

1. Ingegnere un seno linea di cellule di cancro per stabilmente espressione CMV-driven luciferasi Renilla come descritto sopra. Ripetere questaprocesso di progettazione con CMV-driven luciferasi di lucciola in una seconda distinta linea di cellule di cancro al seno.
2. Qui ci mista Renilla luciferasi cellule esprimenti 4T1 con loro e non metastatici isogenico lucciola luciferasi-esprimenti controparti 4T07 ^{10, 11.} Rapporti variabili di queste popolazioni miste di cellule di cancro al seno sono successivamente iniettato nel grasso mammario pad come descritto sopra.
3. Subito acquisire sia lucciola e Renilla immagini luciferasi di stabilire iniziale RLRs rappresentante di una determinata miscela cellulari inoculate.
4. Longitudinale di imaging bioluminescente dual visualizzerà ed i cambiamenti nella composizione cellulare all'interno del tumore primario, nonché l'metastasi spazio-temporale di ciascun derivato cancro al seno rispetto alla crescita e progressione tumorale.
5. In alternativa, le singole cellule di cancro al seno popolazioni possono essere inoculati in posizioni diverse nel topo (cioè destra e sinistra addominali cuscinetti di grasso mammario)per valutare le influenze sistemiche queste due popolazioni presentano uno sull'altro durante varie fasi di crescita tumorale e metastasi.

7. Rappresentante dei risultati:

Un punto di forza duale di imaging bioluminescenti sta nel fatto che ogni immagine è internamente coerente e controllata, in modo tale che i segnali continui derivati ​​dalla funzione di tumore primario come metrica importante per misurare il successo o il fallimento complessivo di ciascun Renilla e acquisizione lucciola. Questo aspetto della procedura di imaging è particolarmente importante durante acquisizioni dell'attività di Renilla luciferasi, il cui Coelenterazine substrato è altamente sensibile all'ossidazione che provoca la sua capacità di auto-luminescenza. La figura 1A mostra un esempio di questo effetto collaterale, che si manifesta immediatamente come non specifici segnali luminescenti derivati ​​dal tratto intestinale non, il tumore primario stabilito. In genere, questi segnali non specifica Coelenterazine transpirseguente indirizzo e non iniezioni endovenose di questo substrato Renilla luciferasi. Tuttavia, una volta robusti primarie derivate da tumori segnali Renilla sono stati ottenuti (Figura 1B, immagine di sinistra), è sicuro di procedere a catturare pathway misurazioni specifiche segnalazione derivati ​​da immagini di luciferasi di lucciola (Figura 1B, pannello di destra), la cui D-luciferina substrato è molto stabile a seguito di iniezione IP e produce livelli trascurabili di sfondo auto-luminescenza.

Figura 1. Acquisire Renilla lucciola e-derivato immagini bioluminescenti per calcolare in RLRs vivo. (A) Un esempio di iniezione fallito IV di Coelenterazine conseguente segnale aspecifico dal tratto intestinale. Cerchio e PT indicare la posizione approssimativa del tumore primitivo. (B) Un acquisto Renilla di successo di un topo che porta un tumore primario e 4T1 pmetastasi ulmonary (pannello di sinistra; 4wk dopo l'attecchimento cuscinetto adiposo). L'acquisizione corrispondente lucciola permette di calcolare RLRs sia dal tumore primario e delle sue metastasi polmonari. (C) Rappresentazione grafica del tumore primario e delle metastasi polmonari RLRs calcolata da topi mostrato nel pannello B (n = 4).

Discussione

Il potere assoluto di tecniche di imaging bioluminescenti risiede nella loro capacità di quantificare la crescita tumorale e metastasi in complessi studi longitudinali, che qui coinvolto l'uso di cellule 4T1 cancro al seno aggressivi. Poiché queste procedure contare sulla integrazione stabile di due costrutti reporter luciferasi, queste tecniche possono essere prontamente adattato e tradotto in altre linee cellulari tumorali di varia latenze tumorali metastatiche e capacità. Simile ai risultati mostrati qui, calcolando RLRs specifici all'interno lentamente sviluppare tumori primari e delle loro metastasi eventuali permette di identificazione in tempo reale spazio-temporale di specifici eventi di segnalazione che traspaiono durante la progressione metastatica di tumori indipendentemente dalla durata di latenza. Previa identificazione di eventi promotore specifico normativi, è importante accise sia del tumore primario e delle sue metastasi per l'esecuzione di immunoistochimica standard e differenziazionel analisi di espressione genica di verificare regolamento analogo del gene endogeno e / o proteine.

Tecnicamente parlando, la sfida principale della doppia analisi bioluminescenti sta nella durata relativamente breve dei segnali Renilla luciferasi. Come tale, questa tecnica di imaging richiede significativa ottimizzazione della procedura di iniezione vena della coda, così come l'imaging immediato di singoli animali iniettati, un processo che richiede tempo e relativo piuttosto inefficiente per l'imaging luciferasi di lucciola. Recentemente, Promega introdotto "Viviren", che rappresenta un secondo substrato di luciferasi generazione i cui siti di ossidazione sono bloccati da esterificazione finché questa iscrizione molecola guadagni in cellule, a questo punto la molecola è rapidamente deesterificata. Collettivamente, questo substrato romanzo riduce efficacemente auto-luminescenza e aspecifici modifica e / o degradazione accoppiato Renilla indotta auto-luminescenza ^12. In tal modo, questa nuova renillun substrato di luciferasi produce brillanti segnali luminescenti, tuttavia, i costi eccessivi connessi con l'acquisizione e l'uso di "Viviren" hanno fornito relativamente pochi gli studi necessari per valutare l'utilità generale di questo substrato in due analisi bioluminescenti. Infine, la sensibilità di qualsiasi saggio di bioluminescenza è criticamente dipendente dalla camera CCD operante ad acquisire singole unità leggere. Infatti, come queste tecnologie migliorano, si prevede un punto nel futuro in cui la nostra capacità di visualizzare complesse reazioni bioluminescenti luce-mediate possono trasparire in modo efficiente in animali liberi in movimento ^13.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vector	Promega	E6751
Glomax Mult-idection sistema	Promega
IVIS serie 200	Caliper Life Sciences
Duale luciferasi giornalista sistema Assay	Promega	E1960
Rediject coelenterazina-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Sale	Caliper Life Sciences	122796