생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

요약

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을 설명 생체 내.

초록

언제 어떻게 전이성 사이트에 설립 된 주요 종양에서 유방암 세포의 운송은 생체 발광 생물 이미징 기술 ^1-3에서의 출현 이후 뛰어난 속도로 증가에 대한 우리의 이해. 사실, 연구자 유방암 전이를 조사하는 방법 혁명을 한 특정 시험 시간에 동물의 개인 그룹을 희생 반대로 연구의 완료에 동물의 단일 일대에 길이 방향으로 종양 성장을 찾아 정량화 할 수있는 능력. 불행하게도, 현재 방법론은 유방암 세포는 (i), 기본 종양에서 진화 (II) 몸 전체에 보급, 그리고 (iii)의 사이트에서 proliferative 프로그램 걸 다시 시작과 같은 세포 신호 시스템에서 발산 중요한 변경 사항을 실시간으로 평가를 배제 전이성 병변. 그러나, 발광 생물 이미징의 최근 발전은 지금은 가능한 동시에 특정 spatiotempor을 수량화 할 수 있도록알 듀얼 기판 발광 반응의 사용을 통해 종양 개발 및 전이성 진행의 함수로 유전자 발현의 변화. 이렇게하려면, 연구자들은 이전에 체외 셀에에서 자신의 폭 넓은 확산 사용을 촉진 상호 배타적 인 기판에 반응 둘의 반딧불 (Photinus pyralis)와 바다 팬지 (Renilla의 reniformis)에서 분리 2 개의 광 - 생산 루시 페라 제 효소에 활용 기반 기자 유전자 assays ^4. 여기 두 번째 발광 반응은 종양의 독특한 단계에서 특정 신호 시스템의 정품 인증 상태를 시각화하는 수단으로 역할을 반면 발광 반응은 구체적으로 크기와 개발 종양의 위치를 표시하는 등이 두 효소의 생체 유틸리티를 보여 및 전이 개발. 따라서, 본 연구의 목적은 두 배입니다. 첫째, 우리는 듀얼 발광 생물 기자 셀 라인을 구축하는 데 필요한 단계를 설명합니다초,뿐만 아니라 전이성 폭포의 특정 단계에서 유전자 발현의 spatiotemporal 규정을 시각화에서 자신의 사용을 촉진하는 데 필요한 있습니다. 유방암 전이의 4T1 모델을 사용하여, 우리는 차 종양 ^4-6로 측정이에 비해 합성 Smad 바인딩 요소 (SBE)의 생체 활동에 발기인이 폐 전이에 극적으로 감소 된 것으로 나타났다. 최근 유방암 전이는 그 섬유 아세포에서 발생하고 면역 세포에게 ^7-9 침투를 포함한 기본 종양 microenvironment와 반응 기질 내에서 변경에 의해 규제되는 표시했습니다. 따라서, 우리의 두번째 목적은 유방암의 성장과 전이 중 하나의 동물에서 숨겨 두 개의 정점이 세포 인구의 성장 및 현지화를 모니터링의 듀얼 발광 생물 기술의 유틸리티를 증명하는 것입니다.

프로토콜

1. CMV 기반 Renilla의 루시 페라 제의 안정적인 표현

1. 안정적인 clonal 인구의 Transfection 및 선택이 renilla 루시 페라 제 리포터의 표현에 주로 사용되는 방법입니다. 이 방법은 추가 보조 기자 구조 (예를 들어, 반딧불 루시 페라 나 형광 단백질)의 후속 소개에 따라 좀 더 일관성 있고 균일 한 renilla 루시 페라 제 표현을 산출.
2. 이러한 pcDNA3.1 - Hygro 또는 다른 플라스미드 숨겨 선택 마커로 표현 벡터 인코딩 renilla의 루시 페라 제와 관심 악성 세포를, Transfect.
3. transfection 후, 이후 개별적으로 subcultured 분리 개인 식민지의 고립을 촉진하기 일 - 투 - 주 몇 가지에 대해 최적화 된 항생제 농도에 따라 transfectants를 놓습니다.
4. renilla 표현의 범위를 모니터링 할 수 ≥ 10 개인 renilla 루시 페라 제 - 표현 식민지을 선택합니다.
식민지가 이후 기능의 대상이있는 것은 자신의 부모 대응의은 (i) pathophysiological 특성이 유지되는 것을 보장하기 위해 분석, 그리고 (ii) renilla 표현 값이 이탈하거나 시간이 지남에 변경하지 마십시오. 이 단계는 clonal 변형 / 변태를 분리하고 공부 방지 할 수 있으며, 게놈에 renilla 구조의 적절한 통합을 검증하기 위해 절대적으로 필수적입니다.
5. 안정적인 transfectant이 분리 확인되면, 하나는 선택적 압력을 제거 할 수 있으며 renilla 루시 페라 제의 표현은 체외 및 생체에서 모두 오랜 시간 길이를 통해 일정하게 유지되므로 안심.

2. 표현, 선택, 그리고 Inducible 발기인 기반 반딧불 루시 페라 제의 기능 확인

1. (예를 들어, PUR 선택 마커를 품고 플라스미드 pGL4 - 루시 페라 제 리포터에 관심 증진을 Subclone안정적인 renilla 표현 (예를 들어, hygromycin)을 선택하는 데 사용이 구분됩니다 omycin).
2. 단계 I에서와 같이 악성 세포를 Transfect하고, 이후 반딧불 루시 페라 제 - 표현 세포의 안정적인 polyclonal 인구에 선택합니다. 보고서 유전자가 게놈에 통합 위치는 표현과 규정에 잘못된 영향을 이끌어내는 수 있기 때문에, 그것은 강력히은 (i) 리포터 유전자 발현을 보장하기 위해 clonal 사람들에게 반대로 반딧불 루시 페라 제 - 표현 세포의 polyclonal 인구에 대한 선택을 권장합니다 더 정확하게 부모 세포의 내생 유전자의 반영, 그리고 (ii) 유전자 발현에 대한 통합 효과는 이기종 셀 인구에서 평균 및 감소됩니다.
3. 안정적 renilla과 반딧불의 luciferases 모두를 표현하기 위해 설계 악성 세포를 총칭 듀얼 발광 생물 기자 세포, 또는 DBR 세포라고합니다.
4. 전통 <를 사용하여em>는 체외 세포 기반 루시 페라 제 리포터 유전자 assays에서, DBR 세포는 반딧불 루시 페라 제 표현을 규제 있는지 확인 중 긍정적 또는 부정적, transiently이 벡터와 transfected 부모의 세포에서 관찰 그게 조화 된 방식 인치 마찬가지로, renilla의 CMV 중심의 표현이 다양한 휴대 stimulations 또는 치료 조건에 의해 규제되지 않으니되어 있는지 확인합니다.
5. 24 잘 접시에, 그래서 문화 DBR과 부모의 세포를 수행하고, CMV-renilla 원본 및 발기인-반딧불과 이후 transiently 공동 transfect 부모 셀은 DBR 세포를 생성하는 데 사용 생성합니다.
6. 그 후 DBR 관심의 발기인을 조절하고, 이후 반딧불과 Promega 듀얼 루시 페라 제 분석 키트를 사용하여 renilla의 발광을 quantitate 것으로 알려진 요인이나 약리 에이전트와 transfected 부모의 세포를 취급합니다.

3. 4T1 기본 유방 종양 구축

1. 전이성 4T1 유방 암 세포를 우리부족 adventitial 쥐 병원균에 발견 다시는 안정적으로 CMV 기반 renilla의 루시 페라 제 (pcDNA3.1-CMV-renilla 루시 페라 제 - hygro)와 SBE 중심 반딧불 루시 페라 제 (pGL4.2-SBE-반딧불 루시 페라-puro) 등을 표현할 수 있도록 설계되었습니다 위의 설명. 주로 폐의 자연 metastases의 형성에 이러한 유방암 세포 결과 Orthotopic engraftment.
2. 4T1 세포는 기존의 2 차원 조직 배양 시스템에서의 전파 중에 합류에 도달 할 수 없습니다해야합니다, 그들은 자신의 생체에 접종에 전에 하루 passaged해야합니다.
3. 4T1 세포가 trypsinization하여 dissociated 수, 성장 미디어에서 철저하게 세척하고, 2x10 ⁵ 세포 / ML의 농도로 PBS에 희석 즉시 얼음에 저장해야합니다.
4. 여성 Balb / C 마우스 (4-6 주 이내)는 isoflurane과 1퍼센트 isoflurane의 복용에 마취하에 유지 3 %의 유도 복용과 anesthetized해야합니다. 와 보라고하여 주사 사이트를 준비70% 이소 프로필 알코올. 집게를 사용 부드럽게 파악하고 4 사타구니 유방 패드를 올린다. 조심스럽게, 27.5 게이지 바늘 베벨면을 넣고 복강에 바늘을 밀어 특별하지 돌봐 직접 유두 아래의 유방 지방 패드에 삽입. 선을 떼고 천천히 유방 지방 패드에 세포 현탁액 (1x10 ⁴ 셀)의 50 μl를 삽입.

4. 초기 듀얼 발광 이미징

1. 즉시 유방 지방 패드에 4T1 세포를 engrafting 뒤와 마우스가 여전히 anesthetized 반면, 측 방향 꼬리 정맥에 RediJect Coelenterazine 100 μl를 삽입. 이 동물 용납 공급 업체 및 가장에서 권장하는 최적의 기판 농도입니다.
2. 즉시 IVIS-200 이미징 시스템 내에서 isoflurane 코 콘에 마우스를 놓고 0.5-1 분 발광 이미지를 획득. 사출 및 이미지 수집 사이의 효율성은 신호로, 매우 중요합니다renilla의 루시 페라 제를 위해 precipitously 떨어 ~ 30초 후 분사. 그 케이지에 다시 마우스를 놓고 그 잔여 renilla의 루시 페라 신호가 소산 것을하고 마우스가 완전히 마취로부터 복구되었습니다 보장 ≥ 1 시간에 복구 할 수 있습니다.
3. IP 분사를 통해 150 MG / D-luciferin의 칼륨 소금의 kg을 관리하고 5 분 기다리십시오. 이 테스트 동물로의 주입에 따라 5~15분에 대한 안정적인 발광 신호를 제공하는 D-luciferin의 최적 농도이다. isoflourane를 사용하여 마우스를 마취하고 IVIS-200에 바꿀, 원래 renilla 인수에 상대적으로 매우 유사한 위치에 동물을 배치하는 관리 하는것. 이 반딧불 신호의 전체 강도 관심의 발기인의 활동에 따라 달라집니다, 그리고 등, 시각화 반딧불의 루시 페라 제 활동은 확장 획득 시간을 필요로 할 수 있습니다.
4. "광자"모드로 설정 IVIS 생활 이미지 소프트웨어를 사용, valu을 수립renilla 및 기준 상대 발광 비율 (RLR)을 설립 할 수있는 수단으로 반딧불을 인수 모두에 대한 에스.

5. 세로 발광 이미징

1. 4T1 세포 매우 적극적이며, 1x10 ⁴ 셀의 등이 접종은 일반적으로 일주일 내에 만져서 알 수있는 종양 형성에 이르게하고, 4-5주 내에서 동물의 lethality에. 4T1 종양은 주 4 고유 한 성향의 궤양이 생기게하다 수 있습니다. ulcerated 종양의 성장 및 유지 보수는 별도의 IACUC 승인을 필요로 할 수 있습니다. 여기에 표시된 4T1 종양이 연구는 사례 서양 예약 대학에서 IACUC에 의해 승인되었습니다.
2. 위에서 설명한대로, 마우스는 일반적으로 종양의 성장과 전이를 모니터 할뿐만 아니라 D-luciferin와 같이 종양 개발의 다양한 단계에서 경로 별 신호를 모니터 할 RediJect의 Coelenterazine으로 매주 주입해야합니다. renilla 루시 페라 신호가 완전히 인수하기 전에 소산되었습니다 보장하기 위해 때마다주의반딧불의 루시 페라 신호의.
3. 4T1 종양 개발 및 진행으로 renilla 루시 페라 인수는 차 종양의 성장을 정상화하고 추적 할 수있는 수단으로 종양 세포 접종시 측정 된 초기 renilla 값으로 정규화해야합니다. 더 중요한 건, 시간이 지남에 RLR 값을 계산하는 것은 종양의 성장과 진행에 상대적으로 개별 신호 시스템의 시간 규정을 설정합니다.
4. 명백한 폐 전이는 유방 지방 패드로 4T1 세포 engraftment에 따라 3-4 주 이내에 분명해집니다. 기본 종양에 대해 계산 이러한 비해 폐 RLR 값을 비교하는 것은 종양의 성장과 전이에 상대적으로 개별 신호 시스템의 공간적 규정을 설정합니다.

6. 단일 동물의 두 고유 세포 유형의 듀얼 발광 생물 이미징

1. 위에서 설명한대로 안정적으로 표현 CMV 기반 renilla의 루시 페라에 엔지니어 한 유방암 세포 라인. 이 과정을 반복합니다두 번째 뚜렷한 유방암 세포 라인에서 CMV 기반 반딧불의 루시 페라 제를 사용하여 엔지니어링 프로세스.
2. 여기에 우리 혼합 renilla 루시 페라 제 - 표현의 nonmetastatic과 isogenic 반딧불 루시 페라 제 - 표현 4T07 대응 ^{10, 11} 4T1 세포를. 이러한 혼합 유방암 세포 인구의 변화 비율은 이후 위에서 설명한 유방 지방 패드에 주입되어 있습니다.
3. 즉시 주어진 주사 세포 혼합물의 초기 RLRs 담당자를 확립하기 위해 반딧불과 renilla 루시 페라 제 이미지를 모두 취득.
4. 길이 듀얼 발광 생물 이미징은 시각화하고 기본 종양 내의 세포 성분의 변화뿐만 아니라 종양의 성장과 진행에 비해 각각 유방암 파생의 spatiotemporal 전이를 추적합니다.
5. 또한, 개별 유방암 세포 인구는 (오른쪽과 왼쪽 복부 유방 지방 패드를 IE) 마우스에서 다른 위치로 주사 할 수 있습니다전신 영향을 평가하기 위해이 두 집단은 종양의 성장과 전이의 여러 단계에서 서로를 통해 나타냅니다.

7. 대표 결과 :

듀얼 발광 생물 이미징의 주요 장점은 각각의 이미지가 내부적으로 일관되고 제어, 중요한 통계를 기본 종양이 함수에서 파생 지속적인 신호는 각 renilla과 반딧불 획득의 전반적인 성공 또는 실패를 측정 할 수 있도록라는 사실에 자리 잡고 있습니다. 이미징 절차의 이러한 양상은 Coelenterazine 기판 산화에 매우 민감 renilla 루시 페라 제의 활동을 인수하는 동안 특히 중요합니다 그 자동 발광하는 능력의 결과. 그림 1A는 즉시 창자가 아닌 기존 차 종양에서 파생 특이 현상 발광 신호로 승객 명단이 부작용의 예를 보여줍니다. 일반적으로 이러한 특이 현상 Coelenterazine는 transpir 신호를전자 다음은이 renilla 루시 페라 제 기판의 정맥 주사에​​ 실패했습니다. 그러나, 한 번 강력한 차 종양 파생 renilla 신호는 (그림 1B, 왼쪽 이미지) 획득했습니다, 그것은 누구의 D-luciferin 영상 반딧불 루시 페라 제 (그림 1B, 오른쪽 패널)에서 파생 된 경로 별 신호 측정을 캡처에 진행하는 것이 안전합니다 기판 IP 주사시 매우 안정과 배경 자동 발광의 무시할 수준을 생산하고 있습니다.

그림 1. renilla과 창자에서 특이 현상 신호의 결과 Coelenterazine의 실패 IV 주입의 반딧불 - 파생 생체 RLRs에서 계산하는 발광 생물 이미지를. (A) 예를 취득. 원과 태평양 표준시는 기본 종양의 대략적인 위치를 나타냅니다. (B) 마우스의 성공적인 renilla 인수가 4T1 차 종양 및 P 베어링ulmonary metastases (왼쪽 패널, 지방 패드 engraftment 후 4wk). 해당 반딧불 취득은 기본 종양과 폐 metastases 모두에서 RLRs의 계산 할 수 있습니다. 패널 B에 표시된 마우스 (N = 4)에서 계산 (C)의 기본 종양의 그래픽 표현과 폐 전이의 RLRs이 있습니다.

토론

발광 생물 이미징 기술의 절대 권력은 여기에 공격적인 4T1 유방암 세포의 사용을 포함 복잡한 길이 방향 연구에서 종양 성장과 전이를 정할 수있는 능력에 있습니다. 이러한 절차가 모두 루시 페라 제 리포터 구조의 안정 통합에 의존하기 때문에,이 기술이 쉽게 적응하고 종양 대기 시간 및 전이성 기능을 다양한 다른 암 세포 라인에 번역 할 수 있습니다. 여기 표시된 결과와 마찬가지로, 천천히 차 종양과 최종 metastases을 개발하고 내 특정 RLRs를 계산하면 대기 시간의 기간에 관계없이 종양의 전이성 진행 중에 발산 특정 신호 이벤트의 실시간 spatiotemporal 식별 할 수 있습니다. 특정 발기인 규제의 이벤트 식별되면, 그것은 소비세 차 종양과 전이성 병변 표준 immunohistochemical의 성능 및 differentia 모두 중요합니다난 유전자 발현 분석은 내생 유전자 및 / 또는 단백질의 유사한 규정을 확인하십시오.

기술적으로 듀얼 발광 생물 분석의 주요 과제는 renilla 루시 페라 신호의 상대적으로 짧은 기간에 자리 잡고, 말하기. 따라서,이 영상 기술은 꼬리 정맥 주입 절차의 상당 최적화뿐만 아니라, 개별적으로 주입 동물의 즉시 이미지, 시간 이미지 반딧불의 루시 페라 제를 소모하고 다소 비효율적와 관련되어있는 프로세스가 필요합니다. 최근 Promega는 산화의 사이트 분자가 빠르게 해제 esterified입니다 시점에서 세포에이 분자 향상 항목까지 에스테르 화에 의해 차단되는 2 세대 루시 페라 기판을 나타냅니다 "Viviren"을 소개했다. 이하,이 소설 기판 효과적으로 renilla 유발 자동 발광 ^(12)에 연결된 자동 발광 및 특이 현상 수정 및 / 또는 저하를 낮 춥니 다. 이렇게,이 새로운 renill루시 페라 제 기판은 밝은 발광 신호를 생성하지만, "Viviren"의 수집 및 이용과 관련된 과도한 비용은 듀얼 발광 생물 분석이 기판의 전반적인 유틸리티를 평가하는 데 필요한 상대적으로 몇 가지 연구를 제공하고 있습니다. 마지막으로, 어떤 발광 생물 검정의 감도 개별 빛 단위를 취득에 operant CCD 카메라에 따라 매우 달라집니다. 이러한 기술이 개선되면 실제로, 우리는 복잡한 빛을 매개 발광 생물 반응을 시각화하는 능력이 무료 이동 동물 ¹³ 효율적으로 발산 할 수 있습니다 미래에 지점을 예견.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
pGL4.2 - Puro [luc2 / Puro] 벡터	Promega	E6751
Glomax 복수 - idection 시스템	Promega
IVIS 200 시리즈	캘리퍼스 생명 과학
듀얼 루시 페라 제 리포터 분석 시스템	Promega	E1960
Rediject coelenterazine-H	캘리퍼스 생명 과학	760506
D-Luciferin K-소금	캘리퍼스 생명 과학	122796