במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Summary

להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה וגרורותיהם In vivo.

Abstract

ההבנה שלנו של איך ומתי מעבר תאי סרטן השד מגידולים ראשוניים שנקבעו לאתרים גרורתי גדל בקצב יוצא דופן מאז כניסתו של in vivo bioluminescent הדמית ^1-3 טכנולוגיות. ואכן, היכולת לאתר ולכמת את צמיחת גידול longitudinally בקבוצה אחת של בעלי חיים להשלמת המחקר בניגוד להקרבת קבוצות בודדות של בעלי חיים בזמני assay ספציפיים חולל המהפכה באופן חוקרים לחקור גרורות סרטן השד. למרבה הצער, שיטות נוכחיות מונעות הערכה בזמן אמת של שינויים קריטיים שלהתרחש במערכות איתות של תאים כמו תאי סרטן שד (i) להתפתח בתוך גידולים ראשוניים, (ii) להפיץ בכל הגוף, וכן (iii) reinitiate תוכניות שגשוג באתרים של נגע גרורתי. עם זאת, הפיתוחים אחרונים בתחום הדמית bioluminescent עכשיו לעשות את זה אפשרי בו זמנית לכמת spatiotempor הספציפיאל שינויים בביטוי גנים כפונקציה של התפתחות גידול והתקדמות גרורתי באמצעות השימוש בתגובות הארת מצע כפולות. כדי לעשות זאת, חוקרים לנצל לשני אנזימי וציפראז אור לייצור שבודדו מהגחלילית (Photinus pyralis) וים האמנון והתמר (reniformis Renilla), אשר שניהם מגיבים למצעים סותרים שאפשרו בעבר השימוש נרחב-בתא במבחנה מבוססי מבחני כתב גני ^4. כאן אנו מדגימים בשירות vivo של שני אנזימים כאלה שתגובת ההארה 1 מציינת במפורש את הגודל והמיקום של גידול מתפתח, תוך תגובת הזורח 2 משמשת אמצעי כדי להמחיש את מצב ההפעלה של מערכות איתות מסוימות במהלך שלבים שונים של גידול אלה והתפתחות גרורה. לפיכך, המטרות של מחקר זה הן כפולות. ראשית, נתאר את הצעדים הדרושים להקמת שורת תאים כפולה bioluminescent כתבזה, כמו גם אלו הנדרשים על מנת להקל את השימוש בם בחלל ובזמן לדמיין את הוויסות של ביטוי גנים בשלבים מסוימים של המפל גרורתי. שימוש במודל 4T1 של גרורות סרטן השד, אנו מראים כי בפעילות vivo של אלמנט כריכת Smad סינטטי (SBE) אמרגן היה ירידה דרמטית בגרורות ריאתי בהשוואה לזה שנמדד בגידול הראשוני ^4-6. לאחרונה, גרורות סרטן השד הוצגו להיות מוסדרות על ידי שינויים במייקרו הגידול הראשוני וstroma תגובתי, כולל אלה המתרחשים בfibroblasts וחדירת תאי מערכת חיסון ^7-9. לפיכך, המטרה השנייה שלנו תהיה להדגים את התועלת של טכניקות bioluminescent כפולות בניטור הגידול והלוקליזציה של שתי אוכלוסיות תאים ייחודיות קננו בתוך חיים אחד במהלך צמיחה וגרורות סרטן השד.

Protocol

1. ביטוי יציב של לוציפראז Renilla CMV-Driven

1. Transfection ובחירה של אוכלוסייה משובטת יציבה הוא השיטה המועדפת לביטוי של עיתונאי לוציפראז renilla זה. גישה זו מניבה ביטוי לוציפראז renilla עקבי ואחיד יותר בעקבות הכניסה הבאה של מבנים משניים נוספים כתב (למשל, הגחלילית לוציפראז או חלבוני ניאון).
2. Transfect תאים ממאירים עניין עם בלוציפראז renilla קידוד וקטור הביטוי, כגון pcDNA3.1-Hygro או אחר פלסמיד מחסה סמן בחירה.
3. בעקבות transfection, למקם את transfectants תחת ריכוז אנטיביוטיקה מותאם למספר ימים-to-שבועות כדי להקל על הבידוד של מושבות בודדות, אשר בודדו בהמשך בנפרד וsubcultured.
4. בחר ≥ 10 מושבות renilla בודדות לוציפראז מבטא-לפקח על מידת ביטוי renilla.
מבטאות כמויות גבוהות של לוציפראז renilla חשופות להמשך תפקודי מנתח כדי להבטיח ש( i) את מאפייני pathophysiological של עמיתי הוריהם נשמרים, וכן (ii) ערכי הביטוי renilla אינם חורג או השינוי לאורך זמן. פעולות אלה הן חיוניים כדי למנוע בידוד ולומד גרסות / סוטים משובטות, וכדי לאמת את שילוב נכון של מבנה renilla לתוך הגנום.
5. ברגע transfectant יציב מבודד ואומת, אפשר להסיר את לחץ הברירה ולהיות סמוכים ובטוח כי הביטוי של לוציפראז renilla יישאר קבוע לאורך אורכי זמן ממושכים במבחנת in vivo.

2. ביטוי, בחירה ואימות פונקציונלית של מושרה Firefly לוציפראז יזם-Driven

1. Subclone האמרגן של עניין לכתב pGL4-לוציפראז פלסמיד מחסה סמן לבחירה (למשל, פורomycin) שהוא שונה מזו משמשת לבחירה לביטוי renilla יציב (למשל, hygromycin).
2. Transfect תאים ממאירים כמו בשלב הראשון, ולאחר מכן בחר לאוכלוסיית polyclonal יציבה של תאי הגחלילית לוציפראז מבטאים-. בגלל המיקום שבו גן הדו"ח משתלב בגנום יכול לעורר תופעות שגויות בביטוי והרגולציה שלה, מומלץ מאוד לבחור עבור אוכלוסיות polyclonal של תאי הגחלילית לוציפראז מבטאים-בניגוד לאוכלוסיות משובטות כדי להבטיח שביטוי גן הכתב (אני) יותר משקף במדויק ששל גן אנדוגני בתאים הוריים, וכן (ii) השפעות אינטגרציה על ביטוי גנים הן ממוצעים ופחתו על פני אוכלוסיית התאים הטרוגנית.
3. תאים ממאירים מהונדסים יציבות לבטא גם luciferases הגחלילית renilla והם מתייחסים אליהם כתאים כפולים bioluminescent כתב, או תאי DBR.
4. שימוש <מסורתיem> במבחני חוץ גופייה מבוססי תאים וציפראז כתב גנים, ודא כי תאי DBR לווסת ביטוי בלוציפראז גחלילית, או חיובי או שלילי, באופן concordant עם זה שנצפה בתאי transfected הורים זמנית עם הווקטורים האלה. כמו כן, ודא שביטוי CMV מונחה של renilla אינו מוסדר על ידי גירויי תאים שונים או בתנאי טיפול.
5. כדי לעשות זאת, התרבות DBR ותאים הוריים בצלחות 24 גם, ולאחר מכן transiently שיתוף transfect תאים הוריים עם CMV-renilla המקורי ואמרגן-גחלילית בונה משמש ליצירת תאי DBR.
6. לאחר מכן, טיפול DBR ותאי הורי transfected עם גורמים או סוכנים תרופתיים ידועים להסדיר את האמרגן של עניין, ולאחר מכן לכמת גחלילית והארת renilla באמצעות ערכת Assay לוציפראז Promega הכפולה.

3. הקמת 4T1 גידולי חלב ראשוניים

1. תאי קרצינומה גרורתי 4T1 חלב שאנומחדש מצא לפתוגנים מכרסמים adventitial חוסר הונדסו ביציבות להביע לוציפראז CMV מונע renilla (pcDNA3.1-CMV-renilla לוציפראז-hygro) וגחלילית לוציפראז SBE מונחה (pGL4.2-SBE-גחלילית לוציפראז-Puro) כ שתואר לעיל. engraftment orthotopic של תוצאות אלו תאי סרטן השד בהיווצרות ספונטניות של גרורות בעיקר לריאות.
2. תאי 4T1 אסור להגיע לנקודת מפגש בהתפשטותם במערכות תרבות מסורתיות 2-ממדי רקמות, והם צריכים להיות passaged היום לפניהם בחיסון גוף חי.
3. תאי 4T1 צריכים להיות מנותקים על ידי trypsinization, שטף ביסודיות בתקשורת צמיחה, ודילול בPBS לריכוז של 2x10 ⁵ תאים / מ"ל ומאוחסנים באופן מיידי על קרח.
4. נקבות עכברי BALB / C (4-6 שבועות) צריכים להיות מורדמים עם מינון אינדוקציה של 3% isoflurane ונשמר תחת הרדמה במינון של 1% isoflurane. הכן את אתר ההזרקה על ידי ניגוב עם70% אלכוהול רפואי. השימוש במלקחיים, בעדינות לתפוס ולהרים את כרית החלב מפשעתי 4. זהירות, הנח צד פוע מחט מד 27.5 ולהזריק לתוך כרית שומן החלב ישירות מתחת לפטמה, טיפול מיוחד לא לדחוף את המחט לתוך חלל הבטן. שחרר את הבלוטה ולהזריק 50 μl של השעית התא (1x10 ⁴ תאים) לאט לתוך כרית שומן החלב.

4. הדמיה ראשונית כפולה זריח

1. מייד לאחר engrafting תאי 4T1 על כרית שומן החלב ואילו עכברים הם עדיין מורדמים, להזרים 100 μl של Coelenterazine RediJect לתוך וריד הזנב לרוחב. זהו ריכוז המצע האופטימלי מומלצים על ידי היצרן והטוב ביותר הנסבל על ידי בעלי החיים.
2. מייד למקם את העכבר לחרטום isoflurane בתוך מערכת הדמית IVIS-200 ולרכוש תמונה זורחת 0.5-1 דקות. יעילות בין הזרקה ורכישה של תמונה היא חשובה מאוד, כאותללוציפראז renilla יורד בתלילות ~ 30 שניות לאחר ההזרקה. הנח את העכבר בחזרה לכלוב שלו ולאפשר לו להתאושש ל≥ 1 שעה, מה שמבטיח שכל אות לוציפראז renilla שיורים התפוגגה ושהעכבר התאושש לגמרי מההרדמה.
3. לנהל 150 מ"ג / ק"ג של מלח אשלגן D-luciferin באמצעות הזרקת IP ולהמתין 5 דקות. זהו הריכוז האופטימלי של D-luciferin, המספק אות זורחת יציבה במשך 5-15 דקות לאחר החדרתו לבעלי חיים. הרדם את העכבר באמצעות isoflourane ולהחליף בIVIS-200, בטיפול כדי למקם את החיה במיקום יחסי לרכישת renilla המקורית דומה מאוד. העצמה הכוללת של אות גחלילית זה תהיה תלוי בפעילות של האמרגן של עניין, ו, פעילות לוציפראז כדוגמת המחשת גחלילית עשויה לדרוש פעמי רכישה מורחבות.
4. שימוש בתוכנת תמונת חי IVIS המוגדרת למצב "פוטונים", להקים values עבור רכישות גחלילית כאמצעי לבסס יחסי הארה יחסיים בסיסיים (RLR) renilla ו.

5. אורך זריח הדמיה

1. תאי 4T1 הם אגרסיביים מאוד, כך שהחיסון של 1x10 ⁴ תאים בדרך כלל מוביל להיווצרות גידול מוחשית בתוך השבוע 1, והקטלניות של החיה בתוך 4-5 שבועות. גידולי 4T1 יש כיב נטייה טבועה בשבוע 4. הצמיחה והתחזוקה של גידולי כיבים עשויות לדרוש אישור IACUC נפרד. מחקרי הגידול 4T1 מוצגים במסמך זה אושרו על ידי IACUC באוניברסיטת Case Western Reserve.
2. כפי שתואר לעיל, עכברים צריכים להיות מוזרקים שבועיים עם Coelenterazine RediJect לפקח צמיחת גידול כללית וגרורות, וכן עם D-luciferin לפקח איתות מסלול ספציפי במהלך שלבים שונים של התפתחות גידול. היזהר בכל פעם על מנת להבטיח את אות לוציפראז renilla התפוגגה לחלוטין לפני הרכישהשל אות בלוציפראז הגחלילית.
3. כגידולי 4T1 להתפתח ולהתקדם, רכישות וציפראז renilla צריכות להיות מנורמלות לערכי renilla הראשוניים שנמדדו בעת הדבקת תאי גידול כאמצעי לנורמליזציה ולעקוב אחר צמיחת גידול ראשונית. וחשוב יותר, חישוב ערכי RLR לאורך הזמן יקים רגולציה הזמנית של מערכות איתות בודדות יחסית לצמיחה והתקדמות גידול.
4. גרורות ריאה גלויות מתבררות בתוך 3-4 שבועות לאחר engraftment התא 4T1 על כרית שומן החלב. השוואת ערכי RLR ריאות לעומת אלו שמחושבים לגידול הראשוני קובעת תקנה המרחבי של מערכות איתות בודדות יחסית לגידול וגרור.

6. הדמית bioluminescent כפולה של שני סוגי תאים ייחודיים בבעלי חיים יחידים

1. קו אחד מהנדס סרטן שד לתא לוציפראז יציבות הביטוי CMV מונע renilla כפי שתואר לעיל. חזור על פעולה זותהליך הנדסי באמצעות בלוציפראז הגחלילית CMV מונחה על קו שני ברור סרטן שד תא.
2. מסמך זה אנו מעורבים renilla לוציפראז-להביע תאי 4T1 עם עמיתיהם nonmetastatic וisogenic גחלילית לוציפראז מבטאים-4T07 ^{10, 11.} יחסים משתנים של אוכלוסיות אלו מעורבות בסרטן שד תאים מוזרקים לאחר מכן לתוך כרית שומן החלב כמתואר לעיל.
3. מייד לרכוש גם גחלילית ותמונות וציפראז renilla להקים נציג RLRs ראשוני של תערובת תא נתון מחוסנת.
4. הדמית bioluminescent כפולה אורך תהיה לחזות ולעקוב אחר שינויים בהרכב התאי בתוך הגידול הראשוני, כמו גם את גרורת החלל ובזמן של כל נגזרת סרטן שד בהשוואה לצמיחת גידול ולהתפתחותו.
5. לחלופין, אוכלוסיות תאי סרטן השד בודדות יכולות להיות מחוסנות למקומות שונים בעכבר (כלומר רפידות בטן חלב ימניות ושמאליות שומן)כדי להעריך את ההשפעות המערכתיות שתי אוכלוסיות אלה תערוכה על אחד אחר במהלך שלבים שונים של צמיחת גידול וגרור.

7. נציג תוצאות:

כוח עיקרי של הדמית bioluminescent כפולה טמון בעובדה שכל תמונה היא פנימי עקבית ומבוקרת, כך שהאותות המתמשכים הנגזרים מגידול הראשונית הפונקציה כמדד חשוב כדי לאמוד הצלחה או הכישלון הכוללת של כל renilla ורכישת גחלילית. היבט זה של הליך ההדמיה חשוב במיוחד במהלך רכישות של פעילות renilla לוציפראז, Coelenterazine שמצע הוא רגיש מאוד לחמצון כי תוצאות ביכולתה האוטומטית הארה. האיור 1 א מציג דוגמה לאפקט זה צד, שבא לידי ביטוי באופן מיידי כאותות זורחים לא ספציפיים הנגזרים ממערכת העיכול, ולא גידול הראשוני והמבוסס. בדרך כלל, אלה Coelenterazine הספציפי מאותת transpirלהלן דואר נכשל זריקות תוך ורידים של מצע לוציפראז renilla זה. עם זאת, ברגע שאותות עיקריים המופקים מגידול חזקים renilla הושגו (התרשים 1B, תמונה משמאל), זה בטוח להמשיך בלכידת מדידות מסלול איתות ספציפיות הנגזרות מהדמית הגחלילית לוציפראז (1B איור, לוח ימני), שD-luciferin מצע הוא מאוד יציב על הזרקת IP ומייצר רמות זניחות של הארה אוטומטית ברקע.

איור 1. רכישת renilla וגחלילית-נגזר תמונות bioluminescent לחשב בRLRs vivo. () דוגמה להזרקה נכשלה IV של Coelenterazine כתוצאה אות ספציפית ממערכת העיכול. המעגל וPT מצביעים על המיקום המשוער של הגידול הראשוני. (ב ') רכישת renilla מוצלחת של עכבר נושאה גידול ראשוני 4T1 ו-pגרורות ulmonary (פנל שמאלי; 4wk לאחר engraftment כרית שומן). רכישת הגחלילית המקבילה מאפשרת חישוב RLRs הן מהגידול הראשוני והגרורות ריאתיות. (ג) ייצוג גרפי של גידול הראשוני והגרור RLRs ריאתי מחושב מעכברים המוצגים בלוח ב '(n = 4).

Discussion

הכח המוחלט של שיטות הדמית bioluminescent טמון ביכולתם לכמת צמיחת גידול וגרור במחקרים ארוכים טווח מורכבים, שמסמך היה מעורב בשימוש בתאי סרטן אגרסיביים 4T1 שד. בגלל הליכים אלה מסתמכים על שילוב היציב של שני מבני כתב וציפראז, טכניקות אלה יכולים להיות מותאמות בקלות ותורגמו לשורות תאי סרטן אחרות של משתנה latencies סרטני ויכולות גרורתי. בדומה לתוצאות שהוצגו במסמך זה, חישוב RLRs הספציפי בתוך פיתוח גידולים ראשוניים והגרורים שלהם שלאט מאפשר זיהוי החלל ובזמן בזמן האמת של אירועי איתות ספציפיים שלהתרחש במהלך ההתקדמות גרורתית של גידולים ללא קשר לתקופת החביון שלהם. עם זיהוי של אירועים רגולטוריים פרומוטר ספציפיים, חשוב לבלו גם גידול הראשוני וגרורותיה לביצוע immunohistochemical הסטנדרטי ודיפרנציאליניתוח ביטוי גני l לאמת רגולציה דומה של הגן ו / או חלבון אנדוגני.

מבחינה טכנית, האתגר העיקרי של ניתוחי bioluminescent כפולים טמון בתקופה הקצרה יחסית של אותות וציפראז renilla. ככזה, טכניקת הדמיה זו דורשת אופטימיזציה משמעותית של הליך הזרקת וריד הזנב, כמו גם הדמיה המיידית של חיות מוזרקות בנפרד, תהליך שצורך זמן ויחסית מעט יעיל לבלוציפראז גחלילית ההדמיה. לאחרונה, הציגה Promega "Viviren", המייצג את מצע לוציפראז דור שני שאתרים של חמצון נחסמו על ידי esterification עד לכניסה זו מולקולת רווחים לתוך תאים, ובנקודה זו היא מולקולת מהירות דה אסטרי. באופן קולקטיבי, מצע הרומן הזה ביעילות מוריד אוטומטי הארה ולא ספציפי שינוי ו / או שפלה מצמיד עד ¹² renilla-Induced אוטומטי הארה. בתוך כך, renill החדשמצע לוציפראז מייצר אותות זורחים בהירים, עם זאת, את העלויות העודפות הקשורות לרכישה ושימוש ב" Viviren "ספקו יחסית מעט מחקרים דרושים כדי להעריך את תכנית השירות הכולל של המצע הזה בניתוחי bioluminescent כפולים. לבסוף, הרגישות של כל assay bioluminescent היא ביקורתי תלויה המצלמה אופרנטית ברכישת יחידות אור בודדות CCD. אכן, כפי שהטכנולוגיות אלה לשפר, אנחנו חוזים נקודה בעתיד שבו היכולת שלנו לחזות את תגובות bioluminescent אור בתיווך מורכבים עשויה להתברר ביעילות בחיות חופשיות נעות ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגים
pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] וקטור	Promega	E6751
מערכת Glomax Mult-idection	Promega
סדרת 200 IVIS	Caliper מדעי חיים
מערכת Assay כפולה לוציפראז כתב	Promega	E1960
Rediject coelenterazine-h	Caliper מדעי חיים	760506
D-luciferin K-סולט	Caliper מדעי חיים	122796