В естественных условиях двойного основания Bioluminescent изображений

Резюме

Здесь мы опишем методы построения, визуализации и количественной оценки биолюминесцентного реакции как светлячков и Renilla люциферазы ферментов выражена в метастатических клеток рака молочной железы в процессе их роста и метастазирования В естественных условиях.

Аннотация

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies ^1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays ⁴. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor ^4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells ^7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

протокол

1. Стабильные Выражение CMV-Driven Renilla Luciferase

1. Трансфекция и отбор стабильного клональных населения является предпочтительным методом для выражения этой Renilla люциферазы репортера. Такой подход дает более плотную и однородную Renilla экспрессии люциферазы после последующего введения дополнительных вторичных конструкций репортер (например, люциферазы светлячка или флуоресцентных белков).
2. Трансфекции опухолевых клеток интересов с кодировкой выражение люциферазы Renilla вектор, таких как pcDNA3.1-гигро или другую плазмиду укрывательство селективного маркера.
3. После трансфекции, разместите трансфектантов под оптимизированной концентрации антибиотика в течение нескольких дней до недели для облегчения выделения отдельных колоний, которые затем выделяют отдельно и пересевают.
4. Выберите ≥ 10 индивидуальных Renilla люциферазы, экспрессирующих колонии для контроля степени Renilla выражение.
5. Колонии выражения больших количествах Renilla люциферазы которые впоследствии подвергаются функциональный анализ, чтобы убедиться, что (я) патофизиологические свойства их родительских партнерами сохраняются, и (II) Renilla значения выражения не отклоняются или меняться с течением времени. Эти действия являются абсолютно необходимыми, чтобы избежать выделения и изучения клонального варианта / извращенцы, а также для проверки надлежащей интеграции Renilla конструкцию в геном.
6. После того, как стабильное трансфектанта выделяют и проверены, можно удалить селективное давление и быть уверены, что выражение Renilla люциферазы будет оставаться постоянным в течение длительного промежутки времени как в пробирке и в естественных условиях.

2. Выражение, выбор и функциональная проверка индуцируемый промотор-Driven люциферазы светляков

1. Субклона промоутер интерес в PGL4-люциферазы репортера плазмиды укрывательство селективного маркера (например, PURomycin), который отличается от используемого выбрать для стабильной экспрессии Renilla (например, гигромицину).
2. Трансфекции опухолевых клеток, как на стадии I, а затем выберите для стабильного поликлональных населения люциферазы светляков-экспрессирующих клеток. Потому что место, где докладе ген встраивается в геном может вызвать ошибочное влияние на его выражения и регулирования, настоятельно рекомендуется выбрать для поликлональных популяций люциферазы светляков-экспрессирующие клетки, в отличие от клональной населения, чтобы (I), репортер экспрессии генов более точно отражает то, что эндогенных генов в родительских клеток, и (II), интеграцию эффектов на экспрессию генов усредняются и уменьшилась по всей гетерогенной популяции клеток.
3. Злокачественные клетки разработана для стабильно выразить как Renilla и светлячков люциферазы в совокупности называют двойным биолюминесцентного клетки репортер, или DBR клеток.
4. При использовании традиционных в пробирке клетки на основе анализа люциферазы гена-репортера, убедитесь, что DBR клетки регулируют люциферазы светляков выражении, либо положительно, либо отрицательно, таким образом, согласные с наблюдаемым в родительских клеток временно трансфицировали с этими векторами. Кроме того, убедитесь, что ЦМВ-управляемые выражения Renilla не регулируется различными раздражениями ячейки или условий лечения.
5. Чтобы сделать это, DBR культуры и родительских клеток в 24-луночных планшетах, а затем временно совместной трансфекции родительских клеток с оригинальным CMV-Renilla и промоутер-светлячка конструкций, использоваться для создания DBR клеток.
6. После этого лечения DBR и трансфицированных родительских клеток с факторами или фармакологических агентов, известных по регулированию промоутер интерес, а затем количественно светлячков и Renilla люминесценции помощью Promega двойной Luciferase Kit анализа.

3. Создание 4T1 первичной опухоли молочной железы

1. Метастатический 4T1 клетки молочной железы рак, что мыповторно обнаружено отсутствие патогенных адвентициальные грызунов были спроектированы, чтобы стабильно выразить CMV-управляемые Renilla люциферазы (pcDNA3.1-CMV-Renilla люцифераза-гигро) и SBE-управляемые люциферазы светляков (pGL4.2-SBE-люциферазы светляков-Puro) в качестве описанные выше. Ортотопическая приживления этих клеток рака молочной железы приводит к образованию спонтанных метастазов в основном в легких.
2. 4T1 клетки не должно быть позволено достичь слияния при их распространении в традиционных 2-мерных систем культуре ткани, и они должны быть пересевать день до прививки в естественных условиях.
3. 4T1 клетки должны быть отделены трипсинизацией, тщательно промывают в питательной среде, и разводили в PBS до концентрации 2х10 ⁵ клеток / мл и сразу же хранили на льду.
4. Женский Balb / C мышей (4-6 недель) должны быть под наркозом с индукцией дозе 3% изофлурана и поддерживается под наркозом в дозе 1% изофлурана. Подготовка месте инъекции путем взятия мазка с70% изопропилового спирта. Используя щипцы, осторожно схватить и поднять 4-й паховых молочных площадку. Аккуратно поместите на 27,5 иглу конической стороной вверх и вводят в молочную жировой ткани непосредственно под соском, уделяя особое внимание не толкать иглу в брюшную полость. Отпустите железы и медленно вводят 50 мкл клеточной суспензии (1x10 ⁴ клеток) в молочной жировой ткани.

4. Начальная двойной люминесцентные изображений

1. Сразу после прививки 4T1 клетки на молочной жировой ткани и в то время как мыши все еще под наркозом, вводят 100 мкл RediJect Coelenterazine в боковую хвостовую вену. Это оптимальная концентрация субстрата рекомендованы производителем и лучшие переносится животными.
2. Немедленно поместите курсор в изофлуран носовым обтекателем в ИВИС-200 системы визуализации и приобрести 0.5-1 минуты люминесцентных изображений. Эффективность между впрыском и получения изображений очень важно, так как сигналдля люциферазы Renilla резко падает ~ 30 секунд после инъекции. Наведите обратно в свою клетку и дать ему восстановиться в течение ≥ 1 часа, который гарантирует, что любой остаточный сигнал люциферазы Renilla, исчезла и что мышь полностью оправился от наркоза.
3. Администрирование 150 мг / кг D-люциферин калийной соли через IP впрыска и подождите 5 минут. Это оптимальная концентрация D-люциферин, который обеспечивает стабильную люминесцентного сигнала в течение 5-15 минут после его введения в подопытных животных. Anesthetize мыши, используя isoflourane и замены в ИВИС-200, заботясь, чтобы поместить животное в очень похожем положении по отношению к оригинальным Renilla приобретения. В целом интенсивность этого сигнала светлячков будет зависеть от активности промотора интерес, и, таким образом, визуализация люциферазы светляков деятельность может потребовать продолжительного времени приобретения.
4. Использование изображений ИВИС Живой программное обеспечение установлено на "фотонов" режиме, установить ценныеES для Renilla и светлячков приобретения в качестве средства для установления базовых относительное соотношение люминесценции (RLR).

5. Продольные люминесцентные изображений

1. 4T1 клетки очень агрессивны, такие, что прививка 1х10 ⁴ клеток обычно приводит к ощутимым образования опухоли в течение 1 недели, и летальность животных в течение 4-5 недель. 4T1 опухоли имеют неотъемлемое изъязвляются склонности в неделю 4. Роста и поддержания изъязвление опухоли может потребовать отдельной IACUC утверждения. 4T1 исследования опухоли показано здесь были одобрены IACUC в Case Western Reserve University.
2. Как описано выше, мышь должна быть введена в неделю с Coelenterazine RediJect контролировать общий рост опухоли и метастазов, а также с D-люциферин отслеживать путь конкретного сигнализации на различных этапах развития опухоли. Будьте осторожны, каждый раз, чтобы обеспечить Renilla люциферазы сигнала полностью рассеивается до приобретениясигнала, люциферазы светлячка.
3. Как 4T1 опухоли развиваются и прогресс, Renilla люциферазы приобретения должны быть нормированы на начальные значения Renilla измеряется в момент инокуляции опухоли клетки в качестве средства для нормализации и отслеживать первичной опухоли. Более того, расчет RLR значения с течением времени будет устанавливать временные регулирования отдельных сигнальных систем по отношению к росту опухоли и прогрессии.
4. Открытые легочных метастазов становится очевидным в течение 3-4 недель после приживления 4T1 клетки на молочной жировой ткани. Сравнение значений легочной RLR по сравнению с рассчитанными для первичной опухоли устанавливает пространственные регулирования отдельных сигнальных систем по отношению к росту опухоли и метастазов.

6. Двойной Bioluminescent изображений из двух уникальных типов клеток в одно животное

1. Инженер одной груди раковые клетки линии стабильно выражения CMV-управляемые Renilla люциферазы, как описано выше. Повторите этотехнологический процесс использования CMV-управляемые люциферазы светляков на второй четкой линии раковых клеток молочной железы.
2. Здесь мы смешанные Renilla люцифераза-экспрессирующих клеток 4T1 с их неметастатическим и изогенных люциферазы светлячка, экспрессирующих 4T07 коллегами ^{10, 11.} Изменение соотношения этих смешанным населением рака молочной железы клетки, впоследствии вводится в молочную жировой ткани, как описано выше.
3. Сразу приобрести как светлячков и Renilla люциферазы изображениями установить начальную представитель RLRs данной прививки смесь клеток.
4. Продольные двойной биолюминесцентного изображения будет визуализировать и отслеживать изменения в клеточном составе в рамках первичной опухоли, а также пространственно-временной метастазы каждая производная раком молочной железы по сравнению с ростом опухоли и прогрессии.
5. Кроме того, отдельные популяции рака молочной железы клетки можно инокулировали в разных местах у мышей (то есть правая и левая брюшной молочных жировых отложений)для оценки системного воздействия этих двух групп населения проявляют друг над другом на различных этапах роста опухоли и метастазов.

7. Представитель Результаты:

Основные силы двойного биолюминесцентного изображений заключается в том, что каждое изображение является внутренне непротиворечивой и контролируемой, так что продолжение сигналов, полученных от основной функцией опухоли как важный показатель для оценки общего успеха или неудачи каждого Renilla и светлячков приобретения. Этот аспект процедура визуализации, что особенно важно во время приобретения деятельность Renilla люциферазы, чьи Coelenterazine подложке очень чувствительны к окислению, что приводит к его способность авто-люминесценции. Рисунок 1А показывает пример такой побочный эффект, который сразу же проявляется в виде неспецифической люминесцентных сигналов, полученных от желудочно-кишечного тракта, не установленных первичной опухоли. Как правило, эти неспецифические Coelenterazine сигнализирует transpirэлектронной следующем удалось внутривенные инъекции этого Renilla люциферазы подложки. Однако, как только надежной первичной опухоли полученные сигналы Renilla были получены (рис. 1б, левое изображение), это безопасно перейти в захвате пути конкретных сигнальных измерений, полученные из изображений люциферазы светляков (рис. 1б, правая панель), чьи D-люциферин подложки высокой стабильностью на IP-инъекции и производит незначительный уровень фонового авто-люминесценции.

Рисунок 1. Приобретение Renilla и светлячков, полученных биолюминесцентного изображения для расчета в естественных условиях RLRs. (A) пример неудачной IV инъекции Coelenterazine в результате неспецифического сигнала от желудочно-кишечного тракта. Круг и PT указать примерное расположение первичной опухоли. (B) успешное приобретение Renilla для мыши подшипников 4T1 первичной опухоли и рulmonary метастазов (на левой панели; 4wk после приживления жира панели). Соответствующее приобретение светлячков позволяет для расчета RLRs как от первичной опухоли и ее метастазами в легких. (C) Графическое представление первичной опухоли и метастазов легочной RLRs рассчитывается от мышей показано на панели B (n = 4).

Обсуждение

Абсолютная власть биолюминесцентных методов визуализации заключается в их способности к количественному росту опухоли и метастазов в сложных продольных исследований, которые здесь связаны с использованием агрессивных 4T1 клеток рака молочной железы. Поскольку эти процедуры рассчитывать на стабильную интеграцию как репортер люциферазы конструкции, эти методы могут быть легко адаптированы и переведены на другие клеточные линии рака различной опухоли задержки и метастатического потенциала. Как и результаты, показанные здесь, расчета конкретных RLRs в медленно развивающихся первичных опухолей и их возможного метастазы позволяет в режиме реального времени пространственно-временные определения конкретных сигнальных событий, что происходить в течение метастатического прогрессирования опухоли независимо от их продолжительности задержки. При выявлении конкретных нормативных промоутер событий, важно акцизного как первичной опухоли и ее метастазов для выполнения стандартных иммуногистохимических и дифференциациял анализ экспрессии генов для проверки Аналогичное положение эндогенного гена и / или белка.

С технической точки зрения, основной проблемой двойного биолюминесцентного анализа заключается в относительно короткий период Renilla люциферазы сигналов. Таким образом, эта техника визуализации требует значительных оптимизации процедуры инъекции хвостовую вену, а также непосредственные изображения индивидуально вводили животным, процесс, который занимает много времени и несколько неэффективной по отношению к люциферазы светлячка изображений. Недавно Promega представил "Viviren", который представляет собой вторую подложку люциферазы поколения, чьи сайты окисления их этерификации, пока эта запись молекулы прибыли в клетки, после чего молекула быстро деэтерифицируют. В совокупности этот роман подложки эффективно снижает авто-люминесценции и неспецифические изменения и / или деградация связана с Renilla-индуцированной люминесценции ^авто-12. При этом, эта новая renillлюциферазы подложке обеспечивает более яркие люминесцентные сигналы, однако чрезмерные расходы, связанные с приобретением и использованием "Viviren" предоставили сравнительно мало исследований, необходимых для оценки общей полезности этого субстрата в двойном биолюминесцентного анализа. Наконец, чувствительность любого биолюминесцентного анализа является решающей степени зависит от камеры CCD оперантного в приобретении отдельных световых единиц. Действительно, как эти технологии улучшаются, мы предвидим в будущем, где наша способность визуализировать сложные свет-опосредованной биолюминесцентного реакции могут происходить эффективно свободное перемещение животных ^13.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vector	Promega	E6751
Glomax Mult-idection системы	Promega
ИВИС серии 200	Суппорт Life Sciences
Двойная система анализа люциферазы репортера	Promega	E1960
Rediject coelenterazine-ч	Суппорт Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Соль	Суппорт Life Sciences	122796