فحص محتوى عالية في أمراض الاعصاب

Summary

نحن تصف منهجية الجمع الآلي زراعة الخلايا على درجة عالية من المحتوى التصوير لتصور وتحديد العمليات الخلوية وهياكل متعددة ، بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد في مثل هذه الأساليب الفنية الشرح مزيد من الجينوم فضلا عن تحديد شبكات الجينات المرض والمخدرات الأهداف المحتملة.

Abstract

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency^1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation⁵. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known^{6, 7}. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long.

There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity⁸. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.

High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues^9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties^{13, 14}. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)^{4, 15-17}. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS.

HCS has many advantages over HTS^{18, 19}, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility.

Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing²⁰ and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism²¹.

Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

Protocol

1. الآلي خلية ثقافة ملتصقة العملية (الشكل 1) ²⁰

1. إعداد خلية ثقافة النظام الآلي لإدخال لوحات ثقافة الخلية. تحميل المواد الاستهلاكية (مثل نصائح ماصة ، لوحات زراعة الخلايا ، لوحات مقايسة) في النظام باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI). الفوسفات مخزنة ضمان عدم وجود ما يكفي من وسائل الإعلام ثقافة الخلية ، المالحة (PBS) ، والتربسين في النظام الآلي.
2. لوحات البذور يدويا omnitray مع اثنين 2 × ⁶ 10 خلايا لكل لوحة ، من خط الخلية العصبية SH - SY5Y. الحفاظ على الخلايا في OPTI - MEM مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). وضع لوحات في الخلية ثقافة الروبوت باستخدام واجهة المستخدم الرسومية. وسيتم المحتضنة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
3. اختيار أي خلية بروتوكول الثقافة يجب أن يكون شرع ^20. يمكن للمرء أن يختار من عملية الخلايا ثقافة ملتصقة ²² ، والتوسع في زراعة الخلايا الجنينية (ES) تغذية الخلايا الجذعية في ²³ أو الماوس للزراعة سل تعليق²² ليرة سورية.
4. حدد خلية ثقافة ملتصقة البروتوكول (الشكل 1) ، وضمان ضبط خلية ملتصقة ملفات معلمة سطر معين بحيث يتم تعيين العتبة التقاء (منطقة من لوحة omnitray يحتوي على خلايا) في 70 ٪. تعيين مجموع الوقت trypsinization إلى دقيقتين.
5. إرشاد الروبوت لإعداد لوحات omnitray جديدة ، مع بذر عدد الخلايا من الخلايا 2 × ⁶ 10 لكل لوحة.
6. لوحات omnitray الإدخال في الخلية باستخدام النظام الآلي الثقافة خلية ثقافة ملتصقة بروتوكول (الشكل 1). هذا البروتوكول ينطوي على الخطوات التالية : يتم تصوير المحتضنة لوحات وحتى وصولها إلى عتبة التقاء محددة مسبقا. إذا الخلايا لا تصل إلى عتبة التقاء في غضون 5 قراءات ، تتم إزالة لوحات من النظام. عند بلوغ عتبة التقاء المعرفة ، تغسل الخلايا ، trypsinized وفرزها. يتم إضافة عدد محدد مسبقا من الخلايا لوحات omnitray جديدة وإذا كان هناك عدد كاف من الخلايا ، وهو مخدر المحدديتم نقلها من لوحات إيه مقايسة إلى سطح السفينة وعدد محدد من الخلايا في كل الاستغناء جيدا. ويمكن تصوير لوحات الفحص مباشرة باستخدام المجهر المتكاملة أو الإخراج من النظام لمزيد من المعالجة.
7. تعليمات النظام لإعداد لوحات مقايسة 4 في لوحة omnitray ، مع ما مجموعه 5000 في الخلايا بشكل جيد.

2. shRNA إنتاج الفيروسات والطلاء في لوحات الفحص (الوقت المطلوب : 6 أيام)

1. تنمو البكتيريا التي تحتوي على مخزونات الجلسرين ناقلات shRNA (فتح النظم البيولوجية ، TRC1) بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام 2ml المتوسطة لوريا ، Bertani تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من ampicilin (سيغما الدريخ).
2. استخراج البلازميدات بعد بروتوكول الشركة المصنعة (Promega معالج MagneSil Tfx).
3. إنتاج الفيروس باستخدام الكونسورتيوم رني الإنتاجية العالية الإنتاج Lentiviral (96 لوحة جيدا) البروتوكول ^24. العمل مع الفيروسة البطيئة هي آمنة نسبيا لأن جزيئات الفيروس المستخدمة لتنبيغ يتم تكرارها من نقص وانقسامتستخدم استراتيجيات التعبئة والتغليف جين لإنتاجها. ومع ذلك ، عند العمل مع الفيروسة البطيئة ، إضافية إجراءات السلامة البيولوجية اللازمة لتقليل الخطر على النفس والآخرين ^25. ويجب إجراء جميع التجارب في مستوى MLII أو BSL2 مختبر السلامة. وينبغي حضنت جميع اللدائن (الماصات ، والأطباق البلاستيكية ، ووسائل الإعلام) التي كان على اتصال مع الجسيمات الفيروسة البطيئة مع التبييض لمدة 24 ساعة قبل التخلص منها.
4. حساب تعدد عدوى (وزارة الداخلية) من الفيروسة البطيئة من خلال تحديد نسبة الخلايا GFP إيجابية باستخدام GFP pLKO.1 البلازميد (سيغما الدريخ).
5. الفيروسة البطيئة لوحة في لوحات مقايسة ، مع وزارة الداخلية من 3.

3. Lentiviral تنبيغ وتمايز الخلايا العصبية من الخلايا SH - SY5Y (الوقت المطلوب : 6 أيام)

1. تضاف إلى الخلايا لوحات الفحص (انظر الخطوة 1.7). تحميل لوحات تحتوي على مقايسة shRNA الفيروسة البطيئة في النظام الآلي خلية ثقافة.
2. بعد 24 ساعة ، وسائل الإعلام علىسيتم تغيير لوحات لفحص OPTI - MEM يحتوي على 0.5 ٪ و 0.1 FBS حمض الريتينويك ميكرومتر لبدء عملية التمايز. تمايز الخلايا SH - SY5Y يسمح التصور من هياكل لالتهاب الأعصاب وتزامن انقسام الخلية.
3. تستمر حضانة لوحات الفحص في وسائل الإعلام التفريق لمدة 5 أيام. هذا يضمن أقصى ضربة قاضية في التعبير الجيني الهدف.
4. في يوم 5 و 50 ميكرومتر إضافة H ₂ O ₂ إلى نصف لوحات الفحص لمدة 24 ساعة لتحفيز إزفاء من DJ1 إلى الميتوكوندريا.
5. في يوم 6 ، إضافة CmxROS Mitotracker (Invitrogen) إلى الخلايا ، وعند تركيز 200 نانومتر النهائي للبئر الواحد واحتضان في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية.
6. يمكن للمرء أن يوعز النظام لوحات الصور مباشرة باستخدام تصوير HC أو يمكن تصديرها لوحات من النظام لمزيد من المعالجة.

4. immunostaining الآلي لوحات الفحص (الوقت المطلوب : 2 أيام)

جودة الصورة paramounر لإجراء HCS حساسة وموثوق بها. يمكن أن الأضرار التي لحقت أحادي الطبقة الخلوية بسبب pipetting غير دقيقة يؤدي إلى سوء جودة الصورة والنتائج irreproducible. وكان من أجل تقليل الضرر طبقة الخلية ، أجرى immunostaining باستخدام محطة الروبوتية. هذا الإجراء هو مشابهة لتلك التي وصفت من قبل ²⁶ ولكن تم تخصيصها لزيادة الإنتاجية وتقليل استخدام المستهلكات.

1. إصلاح الخلايا مع 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4 ٪ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
3. احتضان لوحات مقايسة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ٪ تريتون (PBST) لمدة 10 دقيقة.
4. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
5. احتضان لوحات مقايسة مع 200 ميكرولتر من كتلة عازلة (FBS PBST مع 5 ٪) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
7. احتضان مع الفلبين عشية وضحاها بسبب الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية :
   1. الماعز DJ1 N20 (سانتا كروز ، 5 ميكروغرام / مل)
   2. الأرنب β - III تويولين (سيغما الدريخ ، 1 ميكروغرام / مل)
8. في اليوم التالي ، وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
9. احتضان لوحات مقايسة مع ما يلي الثانوية 1 ساعة الأضداد في درجة حرارة الغرفة :
   1. AlexaFluor 488 حمار المضادة للماعز (Invitrogen ، 2 ميكروغرام / مل)
   2. AlexaFluor 647 الماعز المضادة للأرنب (Invitrogen ، 2 ميكروغرام / مل
10. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
11. احتضان خلايا مع هويشت (Invitrogen ؛ 1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة.
12. غسل الخلايا مع 200 PBS ميكرولتر لمدة 5 دقائق ، 3 مرات.
13. لوحات يمكن تخزين عند 4 درجات مئوية حتى يمكن تصوير فيها.

5. ارتفاع تحليل المحتوى اقتناء وصورة صورة (الوقت المطلوب : 5 أيام)

1. صورة ما مجموعه 30 في حقول جيدا باستخدام عدسة الهدف 20X. تصور DJ1 مع FITC تصفية مجموعة ، الميتوكوندريا مع تعيين مرشح TRITC ، β - III تويولين مع مجموعة Cy5 تصفية ونوى به مجموعة الأشعة فوق البنفسجية مرشح (الشكل 3).
2. تحليل الصور باستخدام التحليل Bioapplication Compartmental (Cellomics ، ThermoFisher) لتحديد متوسط ​​كثافة الإشارة Mitotracker داخل الميتوكوندريا. (الشكل 4B ، F).
3. لتحديد معامل التداخل بين متوسط ​​DJ1 والميتوكوندريا ، وتحليل الصور باستخدام bioapplication Colocalisation Cellomics (Cellomics ، ThermoFisher). تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) على النحو التالي : ROI أ -- النواة (الشكل 4A ، E) ، وعائدات الاستثمار ب -- الميتوكوندريا (الشكل 4 باء ، F). استبعاد ROI ألف باء من عائد الاستثمار لضمان تحليل السيتوبلازم فقط. تحديد المنطقة المستهدفة والميتوكوندريا الأول وDJ1 هدفا المنطقة الثانية (الشكل 4C ، G).
4. تحليل الصور باستخدام bioapplication التنميط متعلق بالخلايا العصبية (Cellomics ، Thermofisher) لتتبع متوسط ​​أطوال neurites من تلطيخ تويولين β - III (الشكل4D ، H).
5. لوحات الصور باستخدام LX أوبرا الآلي مبائر القارئ (بيركن ، إلمر). صورة ما مجموعه 30 في حقول جيدا باستخدام عدسة الهدف 60x مع غمر المياه. تصور الميتوكوندريا مع ليزر 561 نانومتر ، ونوى مع الإثارة الأشعة فوق البنفسجية.
6. تحليل الصور باستخدام سبوت الحافة ريدج (SER) الملمس ميزات الخوارزمية. مرشح SER - ريدج ينقل كثافة في تشكيل خلية الحرف مثل الأنماط. أكثر تجزئة الميتوكوندريا ، وارتفاع درجة SER - ريدج (الشكل 8).

6. تحليل البيانات والتطبيع

1. استيراد البيانات من برمجيات تحليل الصور في حزمة CellHTS2 BioConductor للبيئة برنامج R (R الإصدار 2.11.1 ، الإصدار BioConductor 2.6).
2. قاعدة اللوغاريتم (2) تحويل البيانات السابقة للتطبيع وسيطة مقرها في لوحة ^{27 ، 28.} لا تنطبق تسوية التباين في اللوحة.
3. لتحديد المعدلات من النمط الظاهري ، استخدم ANOVA اتجاهين بين احتدافعت مجموعات NT أي علاج الخلايا المصابة دون علاج ضد سموم تدافعت الخلايا المعالجة مقابل هدف علاج الخلايا الجينات الجين الخلايا مقابل هدف المعالجة (الشكلان 5-7).

7. ممثل النتائج

الطفرات داخل DJ1 تؤدي إلى ظهور باركنسونية المتنحية - ²¹ في وقت مبكر ، ولكن ليس من الواضح مدى فقدان DJ1 يؤدي إلى النمط الظاهري المرض. ومن المعروف أن الخلايا قصور DJ1 هم أكثر عرضة للموت الخلية الإجهاد التأكسدي الناجم عن وردا على الاكسدة ، DJ1 translocates من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا ^{29 ، 30.} عن طريق بناء المقايسات HC لرصد هذه الظواهر ، يمكننا التعرف على الجينات التي تنظم أو تؤثر على الظواهر المرتبطة DJ1. يمكن لهذا النهج أن يساعد في فك المسارات التي يمكن أن تكون ضمن المشاركين DJ1 الوظائف وذلك في التسبب بالمرض.

مثال على التفاعل مع روكبي DJ1 (الشكل 5) : ضربة قاضية للDJ1 في الخلايا المعرضةإلى نتائج توكسين في خسارة أكبر من قابلية الخلية (BAR - B : صورة - B) مقارنة مع الخلايا المصابة تدافعت الفيروسة البطيئة (BAR - A : صورة - A). ضربة قاضية لاستهداف الجين له تأثير مماثل لذلك الذي لوحظ في الخلايا مع ضربة قاضية DJ1 (BAR - C : صورة - C). ضربة قاضية لكل من DJ1 والجينات المستهدفة ويؤدي إلى خسارة أكبر بكثير من بقاء الخلية من الخسارة إما الجينات وحدها (BAR - D : صورة - D). هذا يدل على وجود تفاعل بين روكبي DJ1 واستهداف ألف جينة

مثال على الجينات التي تنظم DJ1 إزفاء (الشكل 6) : عندما تتعرض الخلايا لمادة سامة ، DJ1 translocates من السيتوبلازم إلى الميتوكوندريا ، وهي كمية أعلى من معامل التداخل بين DJ1 والميتوكوندريا (BAR - A : صورة ومقابل BAR - C : صورة C). في الخلايا حيث تم إسكات الجينات المستهدفة B ، وأقل DJ1 translocates إلى الميتوكوندريا عندما تتعرض الخلايا لالسم. هذا يشير إلى أن الهدف هو المشاركة ب الجينات في نقل DJ1 إلى الميتوكوندريا. (BAR - B : صورة وباء BAR D - : صورة D)

مثال على الجين يشارك في ثمرة العصبية (الشكل 7) : ضربة قاضية جيم الجينات المستهدفة في نتائج النوع البري الخلايا SH - SY5Y في زيادة كبيرة في طول neurite (BAR - B : صورة - B) مقارنة مع الخلايا المصابة الفيروسة البطيئة معربا عن تدافعت shRNA (BAR - A : صورة A). يتم فقدان هذا التأثير في الخلايا المحتضنة مع توكسين (BAR - C و D).

مثال على الجين يشارك في التشكل الميتوكوندريا (الشكل 8) : العدوى من الخلايا البرية SH - SY5Y نوع مع shRNA استهداف الجين D النتائج إلى انخفاض في قيمة تجزئة الميتوكوندريا SER - ريدج (الشكل 8 ، C و D صورة) مقارنة الخلايا المصابة مع تدافعت الفيروسة البطيئة (الشكل 8 ، صورة وباء).

الشكل 1 مخطط الآلي خلية بروتوكول الثقافة :

ntent ">
الشكل 2 نظرة عامة تخطيطي لعملية الفرز ، وتحليل الصور والأساليب الإحصائية المستخدمة خلال عملية الفرز : يتم تربيتها ط) حتى تكون خلايا متكدسة ومطلي لاحقا في لوحات تحتوي على مقايسة shRNA الفيروسة البطيئة. هي خلايا متمايزة لمدة 5 ايام وثم اضاف السم إلى لوحات لمدة 24 ساعة. لوحات الفحص يتم إخراج من النظام وimmunostained. يشار إلى كمية الوقت الذي يستغرقه كل من هذه العمليات في أقواس. ب) يتم الحصول على البيانات باستخدام جهاز تصوير HC (بقاء الخلية ، إزفاء البروتين ونمو الخلايا العصبية) ، وتصوير مبائر الآلي (مورفولوجيا الميتوكوندريا). ويتم تصدير البيانات إلى حزمة CellHTS2 داخل R ، وقاعدة (2) وسجل تحول تطبيع. ويستخدم في اتجاهين ANOVA لتحديد تفاعلات كبيرة بين المتغيرات المختلفة.

معشوقة = "jove_content">
الشكل 3. الصور المركبة من الخلايا التي اكتسبها التصوير HC. أ) الخلايا غير المعالجة ، B) خلايا تعامل مع H ₂ O _2. هو المسمى DJ1 باللون الأخضر والأحمر في الميتوكوندريا ونوى في الزرقاء. لم يتم تسليط الضوء Neurite تلطيخ.

الشكل 4. الكمي لميزات عدة الخلوية التي تم الحصول عليها من HCS. م) غير المعالجة SH - SY5Y الخلايا. EH) H ₂ O ₂ تعالج SH - SY5Y الخلايا. A ، E تجزئة النواة) وتعريف العائد على الاستثمار ؛ B ، F) تحديد وتقدير حجم الميتوكوندريا ب ROI ، و C ، G) تحديد DJ1 ، قناة الهدف الثاني ؛ D ، G) تحديد وحساب طول neurite المتوسط. وتستبعد الخلايا على مقربة من حافة الصورة من التحليل. أقحم الصور هي صور قبل التحليل.

الشكل 5. التعرف على الجينات في قشوة مع DJ1 (رسائل على أشرطة تتوافق مع الحروف على الصور). صور A خلال D هي SH - SY5Y الخلايا المسمى مع CMXRos Mitotracker (الحمراء) التي تم استخدامها لتقدير صحة الخلية.

الشكل 6 : تحديد الجين تنظيم DJ1 إزفاء (رسائل على أشرطة تتوافق مع الحروف على الصور). صور A خلال D هي SH - SY5Y الخلايا المسمى لDJ1 (الأخضر) ، الميتوكوندريا (الحمراء) ونوى (الأزرق) التي تم استخدامها لتقدير حجم DJ1 إزفاء إلى الميتوكوندريا.

الرقم 7. تحديد الجين يشارك في ثمرة العصبية (رسائل على أشرطة تتوافق مع الحروف على الصور). صور A خلال D هي SH - SY5Y الخلايا المسمى لβ - III تويولين (الخضراء) ونوى (الأزرق) والتي كانت تستخدم لتحديد مقدار طول neurite.

الشكل 8. تحديد الجين يشارك في تنظيم التشكل الميتوكوندريا. صورة A و C هي صور مركبة من SH - SY5Y الخلايا المصابة مع shRNA مشوشة أو استهداف الجينات shRNA D على التوالي. الميتوكوندريا هي الملونة باللون الأحمر ، بينما هي النواة الملونة باللون الأزرق. صورة B و D هي تصورات لتقدير SER - ريدج.

Discussion

مع تقلص تكاليف HT / HC أنظمة الفحص الخلوي ، جنبا إلى جنب مع توافر الأدوات الجينوم على نطاق وظيفة قوية لتعديل الجينات ، HT / HC شاشات أصبحت شائعة في الأوساط الأكاديمية. وقد تم بالفعل تطبيق هذا النهج بنجاح في مجالات متنوعة من الأبحاث ، مثل تحديد أهداف المخدرات في سرطان ^{9 ، 31-33 ، 34-36} التنمية الجنينية وحتى إمكانية لتطبيقها في فك المسارات المشاركة في الاضطرابات العصبية والنفسية ^37،38. لكن تنفيذ مثل هذا النظام يتطلب استثمارا كبيرا من الوقت والجهد مع عملية التحسين وغالبا ما يأخذ ما لا يقل عن 6 أشهر. جميع الخطوات ، مثل trypsinization مرات ، وبسرعة وكثافة بذر pipetting يتعين تعديلها ، للتأكد من أن الخلايا السليمة وتنمو باستمرار. الوقاية من التلوث الجرثومي هي واحدة من أصعب التحديات التي تواجه الثقافة الآلي خلية الأسبوعية مع بروتوكولات التنظيف في جombination مع الشطف المستمر لجميع خطوط تحمل السائل مع الايثانول 70 ٪ كونها ضرورية للثقافات التلوث الحرة. وسوف يكون من الضروري أيضا تحسين الروبوتات بحيث الأدوات الإضافية ، مثل المجاهر مبائر لدقة أعلى ويمكن أن تكون متكاملة -80 درجة مئوية الثلاجات لتخزين المجمع.

وهناك أيضا القيود التي يتعين معالجتها من أجل تحسين حساسية ، وسرعة وفائدة هذه الطريقة لدراسة شبكات الجينات وتحديد الجينات المسؤولة عن المسارات الجزيئية المسببة للأمراض.

لإجراء الشاشة HT / منسق الشؤون الإنسانية وتحرص على جمع البيانات الموثوق بها ، وجوانب عدة لا بد من تحسينها. أولا ، الاعتماد على قياس أهمية قصوى ، ويعتمد على قوة وحساسية مقايسة. على سبيل المثال ، المقايسات المبينة أعلاه هي مناسبة لشاشات أصغر حجما ، ولكن من الصعب تنفيذها على نطاق واسع الجينوم ، ويرجع ذلك إلى تجهيز عدد الخطوات المطلوبة قبل الحصول على الصور.وهكذا ، فإن المرء لابد لبناء خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن الجينات المراسل ، التي من شأنها أن تسمح للتصوير المباشر ويؤدي إلى تباين انخفضت بسبب انخفاض عدد خطوات التجهيز. في الوقت الحاضر ، تصميم مقايسة أن يصور بدقة وبشكل موثوق الكمي النمط الظاهري للاهتمام هو عقبة رئيسية في عملية الفرز HC.

وتجرى العديد من الشاشات في خلايا الثدييات باستخدام مختلف المكتبات رني ، وكلها تعاني من آثار خارج الهدف ، ومحدودية الكفاءة إسكات الجينات وغير مكتملة تغطية الجينوم. وبالتالي الحاجة إلى المكتبات التي تكون أكثر تحديدا ، قوية ولها تغطية أفضل. هناك جهود جارية لإنشاء مثل هذه ومن المؤمل هذه المساعي من شأنها تحسين استنساخ HT / HC scre ان يضرب.

وجود قيود على العديد من الشاشات الكبيرة الحجم الخلية القائمة على أنها تجري في الخلايا العصبية لأنه لا يمكن التلاعب بها وراثيا وتربيتها لأعداد كبيرة مع السهولة النسبية. ومع ذلك ، فإن أهمية "يضرب" التي حددت في السابق من النماذج الحية لزراعة الخلايا في وظائف الجسم الحي هو مشكوك فيه ، خصوصا أن الدماغ يتكون من أنواع الخلايا المتخصصة جدا التي تشكل شبكة كثيفة ومعقدة من الاتصالات المشبكية لتعمل كوحدة متكاملة إلى حد كبير. نتيجة لذلك ، فمن الشائع أن يضرب تحديدها باستخدام نهج الفرز المبينة أعلاه ، يتم التحقق من صحة في الشاشات الثانوية باستخدام تقنيات إضافية وأكثر النماذج ذات الصلة في ³⁹ الفسيولوجية. من أجل تحسين الترجمة من الزيارات التي تم تحديدها خلال HCS ، ونماذج أكثر تمثيلا وأكثر تطورا ، مثل الخلايا الأولية والخلايا الجذعية أو أنظمة متباينة المشترك ثقافة تحتاج إلى تطوير وتكييفها لHT / HC النهج.

ntent "> مع مزيج من زراعة الخلايا الآلي والتصوير HC أحد يستطيع كسب السريع رؤى جديدة في كيفية الخلايا العصبية وظيفة وتحديد المسارات التي تعتبر هامة لتطور المرض. الجمع بين HCS / HTS البيانات مع المعلومات الناتجة عن النهج الأخرى omics" ، فإنه سيتم عندئذ من الممكن لبناء نظرة عامة على نظم بيولوجيا أمراض الدماغ ، وبالتالي تسهيل التنمية العلاجية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	كتالوج رقم
AI.CELLHOST	HAMILTON	http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/
OPTI - MEM	INVITROGEN	31985-054
حمض الريتينويك	SIGMA الدريخ	R2625
لوحات OMNITRAY	نونك	465219
96 استغلال الثقافة لوحات	جرينير	655086
DJ1 N20 الأضداد	سانتا كروز	SC27004
BETA - III تويولين الأضداد	SIGMA الدريخ	T3952
MITOTRACKER CMXROS	INVITROGEN	M - 7512
هويشت - 33342	INVITROGEN	H1399
هيدروجين البيروكسايد	SIGMA الدريخ	216763 - 100ML
التربسين	INVITROGEN	25050014
مخزنة فوسفات DULBECCO 'Sالمالحة	INVITROGEN	14190086
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX	PROMEGA	A2380
SHRNA الحيوانات المستنسخة	OPEN النظم البيولوجية	http://www.openbiosystems.com / رني / shRNALibraries / TRCLibraryDetails /
BIOAPPLICATIONS CELLOMICS	THERMO - FISHER	http://www.thermo.com/hcs