Method Article
Noi descriviamo una metodologia che combina coltura automatizzati cella con alto contenuto di imaging per visualizzare e quantificare molteplici processi cellulari e le strutture, in un high-throughput modo. Tali metodi possono aiutare nel ulteriore annotazione funzionale dei genomi, oltre a identificare le reti gene della malattia e potenziali bersagli farmacologici.
L'annotazione funzionale dei genomi, la costruzione di reti molecolari e identificazione di droghe nuovo bersaglio, sono sfide importanti che devono essere affrontati come una questione di grande urgenza 1-4. Molteplici approcci complementari 'omiche' hanno fornito indizi utili a capire i fattori di rischio genetici e meccanismi patogenetici alla base di numerose malattie neurodegenerative, ma la maggior parte scoperte richiedono ancora validazione funzionale 5. Per esempio, un recente studio di associazione genome-wide per la malattia di Parkinson (PD), ha individuato loci molti nuovi fattori di rischio per la malattia, ma la variante sottostante causale (s) o meccanismo patogenetico non è noto 6, 7. Come ogni regione associata può contenere diversi geni, la valutazione funzionale di ciascuno dei geni sui fenotipi associati con la malattia, utilizzando le tradizionali tecniche di biologia cellulare sarebbe troppo lungo.
Vi è anche una necessità di comprendere le reti molecolari che colleganomutazioni genetiche per i fenotipi che provocano. Si prevede che i fenotipi della malattia sono il risultato di molteplici interazioni che sono state interrotte. La ricostruzione di queste reti con i tradizionali metodi molecolari sarebbe tempo. Inoltre, le previsioni di rete da studi indipendenti di singoli componenti, l'approccio di riduzionismo, probabilmente sottovaluta la complessità della rete 8. Questa sottovalutazione potrebbe, in parte, spiegare il basso tasso di successo di approvazione dei farmaci a causa degli effetti collaterali o tossici. Ottenere una prospettiva di rete di percorsi malattie correlate con HT / HC approcci di screening cellulare e identificare i nodi chiave all'interno di questi percorsi, potrebbe portare alla individuazione di obiettivi che sono più adatti per un intervento terapeutico.
High-throughput screening (HTS) è una metodologia ideale per affrontare tali questioni 9-12. ma i metodi tradizionali sono stati uni-dimensionale con tutto il bene saggi cellulari, che utilizzati semplificaSTIC letture per i complessi processi biologici. Essi sono stati in grado di quantificare simultaneamente i fenotipi osservati in molte malattie neurodegenerative, come il deficit di trasporto assonale o alterazioni nelle proprietà morfologia 13, 14. Questo approccio non potrebbe essere utilizzato per indagare la natura dinamica dei processi cellulari o eventi patogeni che si verificano in un sottogruppo di cellule. Per quantificare tali caratteristiche si deve passare al multi-dimensionale fenotipi definito alto contenuto di screening (HCS) 4, 15-17. HCS è la cellula-base quantificazione dei processi contemporaneamente, che fornisce una rappresentazione più dettagliata della risposta cellulare a perturbazioni diverse rispetto a HTS.
HCS ha molti vantaggi rispetto HTS 18, 19, ma conducendo una high-throughput (HT)-alto contenuto (HC) schermo nei modelli neuronali è problematico a causa dei costi elevati, variazioni ambientali ed errori umani. Al fine di individuare le risposte cellulari su scala 'phenomics'HC utilizzando immagini si deve ridurre le variazioni ed errori, aumentando la sensibilità e riproducibilità.
Qui descriviamo un metodo per condurre in modo accurato e affidabile schermi shRNA utilizzando colture di cellule automatizzati 20 e HC di imaging neuronale in modelli cellulari. Ci descrivono come abbiamo utilizzato questa metodologia per identificare modulatori per una particolare proteina, DJ1, che se mutato causa parkinsonismo autosomico recessivo 21.
Combinando la versatilità di HC imaging con metodi HT, è possibile quantificare con precisione una pletora di fenotipi. Questo potrebbe essere successivamente utilizzato per far avanzare la nostra comprensione del genoma, i meccanismi coinvolti nella patogenesi della malattia e identificare potenziali bersagli terapeutici.
1. Automatizzata aderente cultura processo cellulare (Figura 1) 20
2. shRNA produzione di virus e placcatura in piastre di test (Tempo di percorrenza: 6 giorni)
3. Trasduzione lentivirali e la differenziazione neuronale delle cellule SH-SY5Y (Tempo di percorrenza: 6 giorni)
4. Immunocolorazione automatizzata delle piastre test (Tempo di percorrenza: 2 giorni)
La qualità dell'immagine è paramount per lo svolgimento di un sensibile e affidabile HCS. Danni al monostrato cellulare a causa di pipettaggio inesatte possono portare a scarsa qualità dell'immagine e dei risultati non riproducibili. Al fine di minimizzare i danni strato di cellule, il immunocolorazione è stata condotta utilizzando una stazione robotica. La procedura è simile a uno che è stato descritto in precedenza 26 ma è stato personalizzato per aumentare la produttività e ridurre l'utilizzo di materiali di consumo.
5. Alto contenuto di immagine acquisizione e analisi delle immagini (Tempo richiesto: 5 giorni)
6. Normalizzazione dei dati e analisi
7. Rappresentante risultati
Le mutazioni all'interno DJ1 dar luogo a esordio precoce-recessiva parkinsonismo 21, ma non è chiaro come la perdita di DJ1 dà origine al fenotipo della malattia. E 'noto che le cellule carenti di DJ1 sono più suscettibili a stress ossidativo indotto la morte cellulare e nella risposta allo stress ossidativo, DJ1 trasloca dal citoplasma ai mitocondri 29, 30. Mediante la costruzione di test HC di monitorare questi fenotipi, siamo in grado di identificare i geni che regolano o influenzano fenotipi associati con DJ1. Questo approccio può aiutare a decifrare i percorsi all'interno del quale DJ1 funzioni e che potrebbero essere coinvolti nella patogenesi della malattia.
Esempio di interazione con epistatico DJ1 (Figura 5): Atterramento di DJ1 in cellule esposteai risultati tossina in una maggiore perdita di vitalità cellulare (BAR-B: image-B) rispetto alle cellule infettate con lentivirus strapazzate (BAR-A: image-A). Knockdown del gene bersaglio A ha un effetto simile a quella osservata nelle cellule con un knockdown DJ1 (BAR-C: image-C). Knockdown sia DJ1 e gene bersaglio Un traduce in una perdita significativamente maggiore di vitalità cellulare di perdita di entrambi i geni da soli (BAR-D: image-D). Questo suggerisce una interazione tra epistatico DJ1 e target gene A.
Esempio di un gene che regola il DJ1 traslocazione (Figura 6): Quando le cellule sono esposte ad una tossina, DJ1 trasloca dal citoplasma ai mitocondri, che è quantificato da un coefficiente maggiore sovrapposizione tra DJ1 ei mitocondri (BAR-A: image A contro BAR-C: image C). Nelle cellule B in cui gene bersaglio è stato messo a tacere, meno DJ1 trasloca ai mitocondri quando le cellule sono esposte alla tossina. Ciò suggerisce che il gene B obiettivo è coinvolto nel trasporto di DJ1 ai mitocondri. (BAR-B: immagine B e BAR-D: image D)
Esempio di un gene coinvolto nella crescita neuronale (Figura 7): Atterramento di C gene bersaglio nel selvaggio tipo SH-SY5Y cellule si traduce in un significativo aumento della lunghezza dei neuriti (BAR-B: image-B) rispetto alle cellule infettate con lentivirus che esprimono strapazzate shRNA (BAR-A: image A). Questo effetto si perde nelle cellule incubate con tossina (BAR-C e D).
Esempio di un gene coinvolto nella morfologia mitocondriale (Figura 8): L'infezione di tipo selvaggio cellule SH-SY5Y con shRNA gene targeting D provocano una diminuzione della mitocondriale SER-Ridge valore di segmentazione (Figura 8, Immagine C e D) rispetto ai cellule infettate con lentivirus strapazzate (Figura 8, Immagine A e B).
Figura 1 Schema di protocollo automatizzato colture cellulari.:
Figura 3. Immagini composite di cellule acquisita da HC imaging. A) le cellule non trattate, B) Le cellule trattate con H 2 O 2. DJ1 è etichettato in verde, i mitocondri in rosso e in blu i nuclei. Colorazione dei neuriti non è evidenziato.
Figura 4. Quantificazione delle tante caratteristiche cellulari ottenute da un HCS. DC) non trattato cellule SH-SY5Y. EH) H 2 O 2 trattati con cellule SH-SY5Y. A, E) Nuclei segmentazione e la definizione del ROI A, B, F) Identificazione e quantificazione dei mitocondri, ROI B, C, G) Identificazione di DJ1, Target canale II, D, G) Identificazione e calcolo della durata media dei neuriti. Le cellule vicino al bordo dell'immagine sono esclusi dall'analisi. Inset immagini sono immagini prima dell'analisi.
Figura 5. Identificazione di un gene in epistasi con DJ1 (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettati con Mitotracker CMXRos (rosso) che è stato utilizzato per la quantificazione della salute delle cellule.
Figura 6. Identificazione di un gene che regola il DJ1 traslocazione (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettato per DJ1 (verde), mitocondri (rosso) e nuclei (blu) che sono stati utilizzati per la quantificazione della traslocazione DJ1 ai mitocondri.
Figura 7. Identificazione di un gene coinvolto nella crescita neuronale (lettere sulle barre corrispondono alle scritte sulle immagini). Immagini dalla A alla D sono cellule SH-SY5Y etichettato per la β-III tubulina (verde) e nuclei (blu) che sono stati utilizzati per la quantificazione della lunghezza dei neuriti.
Figura 8. Identificazione di un gene coinvolto nella regolazione della morfologia mitocondriale. Immagine A e C sono immagini composite di SH-SY5Y cellule infettate con shRNA strapazzate o un gene targeting shRNA D rispettivamente. I mitocondri sono colorati in rosso, mentre i nuclei sono colorati in blu. Immagine B e D sono visualizzazioni di SER-Ridge quantificazione.
Con la diminuzione dei costi di HT / HC sistemi di screening cellulari, unita alla disponibilità di potenti genoma strumenti per modificare la funzione del gene, HT / HC schermi stanno diventando comune nel mondo accademico. L'approccio è già stato applicato con successo a diverse aree di ricerca quali l'identificazione di bersagli farmacologici nel cancro 9, 31-33 e 34-36 lo sviluppo embrionale e ha anche potenzialità di applicazione nel decifrare i meccanismi coinvolti nei disordini neuropsichiatrici 37,38. Tuttavia implementazione di tale sistema richiede un investimento significativo di tempo e fatica con l'ottimizzazione dei processi che spesso prende un minimo di 6 mesi. Tutte le fasi, quali i tempi di tripsinizzazione, velocità di pipettaggio e densità di semina devono essere adeguati, per assicurare che le cellule sono sane e crescono costantemente. Prevenzione della contaminazione batterica è una delle sfide più difficili di fronte cultura automatizzata delle cellule con protocolli di pulizia settimanale in combination con risciacquo costante di tutte le linee di rilevamento liquidi con etanolo al 70% sia necessario per la contaminazione delle culture libero. Sarà inoltre necessario migliorare la robotica in modo che gli strumenti aggiuntivi, come microscopi confocale per una maggiore risoluzione e -80 ° C congelatori per la conservazione composto può essere integrato.
Ci sono anche limitazioni che devono essere affrontate per migliorare la sensibilità, la velocità e l'utilità di questo metodo per lo studio delle reti geniche e identificare i geni coinvolti nei meccanismi patogeni molecolari.
Per condurre un HT / HC schermo e garantire che dati affidabili raccolti, diversi aspetti devono essere ottimizzati. In primo luogo, l'affidabilità della misura è fondamentale e dipende dalla robustezza e la sensibilità del test. Ad esempio, il test sopra descritti sono adatti per schermi di piccole dimensioni, ma sono difficili da implementare su larga scala del genoma, a causa di fasi di lavorazione il numero richiesto prima di acquisizione delle immagini.Quindi, bisognerebbe costruire linee cellulari stabili che esprimono il gene reporter, che consentirebbe per l'imaging diretto e portare a variazioni diminuito a causa del ridotto numero di fasi di lavorazione. Attualmente, la progettazione di un saggio che descrive in modo accurato e affidabile quantifica un fenotipo di interesse è un serio ostacolo nel processo di selezione HC.
Molte schermate sono condotti in cellule di mammifero utilizzando diverse librerie di RNAi, che soffrono di off-target effetti, limitata efficienza silenziamento genico e la copertura del genoma incompleto. Così le biblioteche devono essere effettuate, che sono più specifici, potenti e hanno una migliore copertura. Si sta cercando di creare tale si spera tali sforzi a migliorare la riproducibilità di HT / HC SCRE it hits.
Una limitazione di scala molti schermi a grandi cellule base è che sono condotti in cellule di neuroblastoma perché possono essere geneticamente manipolate e colto ad un gran numero con relativa facilità. Tuttavia, la rilevanza delle 'hit' identificati in modelli ex vivo di coltura cellulare in funzione in vivo è discutibile, soprattutto perché il cervello è composto di tipi di cellule altamente specializzate che formano una fitta rete e complicato delle connessioni sinaptiche di funzionare come unità altamente integrata. Di conseguenza, è frequente che colpisce identificato utilizzando l'approccio di screening di cui sopra, sono convalidati in schermi secondari utilizzando tecniche aggiuntive e in più modelli fisiologici rilevanti 39. Per migliorare la traduzione di visite identificati durante HCS, i modelli più rappresentativi e sofisticati, come le cellule primarie e cellule staminali differenziate o co-coltura sistemi devono essere sviluppati e adattati per HT / HC approcci.
ntent "> Con una combinazione di coltura delle cellule automatizzati e HC di imaging si può rapidamente acquisire nuove conoscenze sul modo in cui i neuroni funzione e determinare quali percorsi sono importanti per lo sviluppo della malattia. Combinando HCS / HTS dati con le informazioni generate da altri approcci 'omiche', sarà poi sarà possibile costruire una visione d'insieme biologia dei sistemi di malattie cerebrali, facilitando così lo sviluppo terapeutico.Non abbiamo nulla da rivelare
Ringraziamo i programmatori Hamilton e specialisti per il supporto continuo e Blaas Eva per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da due sovvenzioni agli investimenti NWO (911-07-031 e 40-00506-98-10011), Il Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 e il Campus di Neuroscienze di Amsterdam; SJ è supportato da Ti-Pharma: T5-207.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ | |
OPTI-MEM | Invitrogen | 31985-054 | |
Acido Retinoico | SIGMA-ALDRICH | R2625 | |
OMNITRAY PIASTRE | NUNC | 465219 | |
96 piastre di coltura BENE | GRENIER | 655086 | |
DJ1 N20 ANTICORPI | SANTA CRUZ | SC27004 | |
BETA-III TUBULINA ANTICORPI | SIGMA-ALDRICH | T3952 | |
MITOTRACKER CMXROS | Invitrogen | M-7512 | |
HOECHST-33342 | Invitrogen | H1399 | |
Perossido di idrogeno | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML | |
Tripsina | Invitrogen | 25050014 | |
FOSFATO Dulbecco Buffered Saline | Invitrogen | 14190086 | |
PROMEGA WIZARD MagneSil TFX | PROMEGA | A2380 | |
ShRNA CLONI | APERTO BIOSISTEMI | http://www.openbiosystems.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / | |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
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