הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

Summary

אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת culturing תא אוטומטי עם דימות גבוהה תוכן כדי לחזות ולכמת תהליכים תאיים רבים ומבנים, באופן תפוקה גבוהה. שיטות כאלה יכולות לסייע ביאור תפקודית נוספת של הגנום, כמו גם לזהות את הגן למחלה רשתות מטרות סמים פוטנציאליים.

Abstract

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency^1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation⁵. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known^{6, 7}. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long.

There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity⁸. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.

High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues^9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties^{13, 14}. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)^{4, 15-17}. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS.

HCS has many advantages over HTS^{18, 19}, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility.

Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing²⁰ and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism²¹.

Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

Protocol

1. תרבות אוטומטי חסיד תא התהליך (איור 1) ²⁰

1. הכן את המערכת האוטומטית תרבית תאים עבור קלט של צלחות תרבית תאים. טען מתכלים (כגון: טיפים פיפטה, תרבות צלחות התא, צלחות assay) לתוך המערכת באמצעות ממשק המשתמש הגרפי (GUI). ודא שיש מספיק בתרבות התקשורת הסלולרי, פוספט בופר סליין (PBS) וכן טריפסין במערכת רובוטית.
2. ידנית two זרע omnitray צלחות עם 2 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת, של קו SH-SY5Y תא נוירובלסטומה. שמרו על התאים Opti-ממ עם סרום 10% שור עוברית (FBS). שים את הצלחות לתוך הרובוט הנייד תרבות באמצעות GUI. התאים יהיה מודגרות ב 37 ° C ו 5% CO _2.
3. בחירת תא פרוטוקול תרבות צריך להיות יזם ^20. אפשר לבחור מתוך תהליך התרבות חסיד תא ^22, culturing והרחבת גזע עובריים (ES) מזין תאים תאים העכבר או ²³ culturing ההשעיה cells ^22.
4. בחר את התא חסיד התרבות פרוטוקול (איור 1) ולהבטיח חסיד קו תא קבצים ספציפיים פרמטר מותאמים כך את הסף מפגש (אזור הצלחת omnitray המכילה תאים) מוגדר על 70%. הגדרת זמן trypsinization הכולל שתי דקות.
5. הדריכו את הרובוט כדי להכין צלחות omnitray החדש, עם מספר זריעת תאים של 2 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת.
6. Omnitray קלט צלחות למערכת התא התרבות באמצעות תרבות אוטומטיות חסיד תא פרוטוקול (איור 1). פרוטוקול זה כולל את השלבים הבאים: צלחות מודגרת הדמיה עד שהם מגיעים לסף מוגדרים מראש מפגש. אם התאים אינם מגיעים לסף מפגש בתוך 5 קריאות, צלחות יוסרו מהמערכת. לאחר שהגיע לסף מפגש המוגדרים על ידי המשתמש, תאים נשטפים, trypsinized וספר. מספר מוגדר מראש של תאים מתווספים צלחות omnitray חדש ואם יש מספר מספיק של תאים, תחושה שצויןאה צלחות assay מועברים הסיפון מספר מוגדר של תאים לוותר לבאר כל אחד. צלחות Assay ניתן הדמיה ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלט משולב או ממערכת לעיבוד נוסף.
7. הדריכו את המערכת להכין 4 צלחות assay לכל צלחת omnitray, עם סך של 5,000 תאים לכל טוב.

2. shRNA הייצור וירוס ציפוי לתוך צלחות assay (הזמן הנדרש: 6 ימים)

1. לגדול מניות גליצרול בקטריאלי המכיל וקטורים shRNA (פתח Biosystems, TRC1) לילה 2ml של לוריא-Bertani התקשורת בינוני המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ampicilin (Sigma-Aldrich).
2. חלץ פלסמידים הבאים פרוטוקול של היצרן (Promega אשף MagneSil Tfx).
3. תוצרת וירוס באמצעות קונסורציום RNAi תפוקה גבוהה הפקה lentiviral (96 צלחת יפה) פרוטוקול ^24. עבודה עם lentivirus הוא בטוח יחסית מפני הווירוס החלקיקים המשמשים התמרה הם השכפול לקוי מפוצלאריזה אסטרטגיות הגן משמשים הייצור שלהם. עם זאת, כאשר עובדים עם lentivirus, נהלים נוספים biosafety נחוצים כדי למזער את הסיכון לעצמו ולאחרים ^25. כל הניסויים חייבים להתנהל מעבדה MLII או BSL2 רמת הבטיחות. כל פלסטיק (טפטפות, צלחות פלסטיק, התקשורת) כי היה במגע עם חלקיקים lentivirus צריך להיות מודגרות עם אקונומיקה למשך 24 שעות לפני סילוק.
4. חישוב ריבוי זיהום (משרד הפנים) של lentivirus על ידי קביעת אחוז התאים ה-GFP חיובי באמצעות GFP pLKO.1 פלסמיד (Sigma-Aldrich).
5. פלייט lentivirus לתוך צלחות assay, עם משרד הפנים של 3.

3. התמרה lentiviral והבחנה עצבית של SH-SY5Y תאים (זמן נדרש: 6 ימים)

1. תאים מתווספים צלחות assay (ראה שלב 1.7). טען צלחות assay המכיל lentivirus shRNA לתוך מערכת תא אוטומטיות תרבות.
2. לאחר 24 שעות, התקשורת עלצלחות assay ישתנו Opti-ממ המכיל 0.5% FBS ו 0.1 החומצה הרטינואית מיקרומטר כדי להתחיל את תהליך הבידול. דיפרנציאציה של SH-SY5Y תאים מאפשר הדמיה של מבנים מדלקת עצבים ומסנכרן חלוקת התא.
3. המשך דגירה של צלחות assay בתקשורת בידול במשך 5 ימים. זה מבטיח מציאה מקסימלי של ביטוי גנים היעד.
4. ביום 5, להוסיף 50 מיקרומטר H ₂ O ₂ למחצית צלחות assay למשך 24 שעות כדי לעורר טרנסלוקציה של DJ1 אל המיטוכונדריה.
5. ביום 6, להוסיף CmxROS Mitotracker (Invitrogen) אל התאים, בריכוז הסופי של 200 ננומטר לכל טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
6. אפשר להנחות את המערכת צלחות התמונה ישירות באמצעות imager HC או צלחות ניתן לייצא מהמערכת לעיבוד נוסף.

4. Immunostaining אוטומטי של לוחיות assay (הזמן הנדרש: 2 ימים)

איכות התמונה היא paramount לניהול HCS רגיש ואמין. נזק monolayer הסלולר בשל pipetting מדויק יכול להוביל איכות התמונה ירודה תוצאות irreproducible. כדי למזער את שכבת נזק לתאים, immunostaining נערך באמצעות תחנת רובוטית. הליך זה דומה לזה אשר תוארה קודם לכן ²⁶ אך הותאם אישית כדי להגדיל את התפוקה ולצמצם את השימוש מתכלים.

1. תקן תאים עם μl 100 paraformaldehyde של 4% טרום חימם עד 37 ° C. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
2. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
3. דגירה צלחות assay עם 200 μl של PBS המכיל טריטון 0.1% (PBST) במשך 10 דקות.
4. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
5. דגירה צלחות assay עם 200 μl של חיץ לחסום (PBST עם 5% FBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
6. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
7. דגירה עם follנוגדנים העיקרי בשל לילה ב 4 ° C:
   1. עיזים DJ1 N20 (סנטה קרוז, 5 מיקרוגרם / מ"ל)
   2. Β-III הארנב טובולין (Sigma-Aldrich, 1 מיקרוגרם / מ"ל)
8. למחרת, לשטוף תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
9. דגירה צלחות assay עם שעה לאחר 1 נוגדנים משני בטמפרטורת החדר:
   1. AlexaFluor 488 חמור נגד עז (Invitrogen, 2 מיקרוגרם / מ"ל)
   2. AlexaFluor 647 עיזים נגד ארנב (Invitrogen, 2 מיקרוגרם / מ"ל
10. שטפו תאים עם 200 μl של PBS במשך 5 דקות, 3 פעמים.
11. תאים דגירה עם Hoechst (Invitrogen; 1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 דקות.
12. שטפו תאים עם 200 PBS μl במשך 5 דקות, 3 פעמים.
13. צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד שהם יכולים להיות הדמיה.

5. תוכן תמונה גבוהה ניתוח הרכישה התמונה (הזמן הנדרש: 5 ימים)

1. תמונה כוללת של 30 שדות לכל גם באמצעות עדשה 20x אובייקטיביות. דמיינו DJ1 עם FITC להגדיר מסנן, המיטוכונדריה עם להגדיר את מסנן TRITC, β-III טובולין עם סט Cy5 המסנן את הגרעינים באמצעות מערכת סינון UV (איור 3).
2. לנתח את התמונות באמצעות Bioapplication ניתוח Compartmental (Cellomics, ThermoFisher) כדי לקבוע את עוצמת הממוצע של האות Mitotracker בתוך המיטוכונדריה. (איור 4B, F).
3. כדי לקבוע את החפיפה הממוצע בין מקדם DJ1 ואת המיטוכונדריה, לנתח את התמונות באמצעות bioapplication Colocalisation Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). הגדרת אזורים של עניין (ROI) כדלקמן: ההחזר על ההשקעה - גרעין (איור 4 א, ה), ההחזר על ההשקעה ב - המיטוכונדריה (איור 4 ב ', ו). תכלול את ההחזר על ההשקעה ROI של B כדי להבטיח ניתוח של הציטופלסמה בלבד. מגדירים את המיטוכונדריה כאזור היעד ואני DJ1 כמטרה באזור II (איור 4C, G).
4. לנתח את התמונות באמצעות bioapplication פרופיל עצבי (Cellomics, Thermofisher) לאתר את אורכי הממוצע של neurites מן מכתים β-III טובולין (איור4D, ח).
5. תמונה צלחות באמצעות LX האופרה אוטומטיות confocal הקורא (פרקין אלמר-). תמונה כוללת של 30 שדות לכל גם באמצעות העדשה אובייקטיבי 60x עם טבילה במים. דמיינו המיטוכונדריה עם לייזר 561 ננומטר גרעינים עם עירור UV.
6. לנתח את התמונות באמצעות Spot-Edge-Ridge (SER) תכונות אלגוריתם מרקם. SER-Ridge מסנן מעביר עוצמת בפיקסלים להרכיב הרכס כמו דפוסים. מקוטעת יותר המיטוכונדריה, ככל שהציון גבוה יותר SER-Ridge (איור 8).

6. נתונים נורמליזציה ניתוח

1. ייבוא ​​נתונים מתוך התוכנה ניתוח התמונה לתוך החבילה BioConductor CellHTS2 לסביבה תוכנה R (R גרסה 2.11.1, הגירסה BioConductor 2.6).
2. בסיס לוגריתם (2) להמיר את הנתונים לפני נורמליזציה לכל צלחת החציוני מבוסס ^{27, 28.} אין ליישם את ההתאמה השונות לכל צלחת.
3. כדי לזהות מכפילי של פנוטיפ, השתמש ANOVA שני בדרך בין different קבוצות הטיפול כלומר מקושקשות בתאים שלא טופלו נגועים לעומת מקושקשות תאים שטופלו נגד הרעלן הגן היעד בתאים שלא טופלו מול גן היעד תאים שטופלו (איורים 5-7).

7. נציג תוצאות

מוטציות בתוך DJ1 להצמיח מוקדם התפרצות-רצסיבי פרקינסון ^21, אך לא ברור איך אובדן DJ1 מעורר פנוטיפ המחלה. ידוע כי התאים לקוי של DJ1 רגישים יותר מוות שנגרמו עקב מתח חמצוני התא בתגובה סטרס חמצוני, DJ1 translocates מן הציטופלסמה של המיטוכונדריה ^{29, 30.} על ידי בניית מבחני בג"צ לפקח פנוטיפים אלה, אנו יכולים לזהות גנים המווסתים או להשפיע על פנוטיפים הקשורים DJ1. גישה זו יכולה לעזור לפענח את המסלולים שבתוכה DJ1 פונקציות וזה יכול להיות מעורב בהיווצרות המחלה.

דוגמה של אינטראקציה עם epistatic DJ1 (איור 5): מציאה של DJ1 בתאים שנחשפותוצאות רעלן לאובדן גדול יותר של כדאיות התא (BAR-B: image-B), לעומת תאים נגועים עם מקושקשות lentivirus (בר: image-A). מציאה של גן המטרה יש השפעה דומה לזו שנצפתה תאים עם מציאה DJ1 (BAR-C: image-C). מציאה של DJ1 וגם גן היעד התוצאות הפסד גדול משמעותית של כדאיות התא מאשר אובדן של גן אחד בלבד (BAR-D: image-D). הדבר מצביע על אינטראקציה בין epistatic DJ1 היעד גנים א

דוגמה של גן ויסות DJ1 טרנסלוקציה (איור 6): כאשר תאים נחשפים רעלן, DJ1 translocates מן הציטופלסמה של המיטוכונדריה, אשר לכמת במקדם חפיפה גבוהה בין DJ1 ואת בר המיטוכונדריה (: תמונה לעומת BAR-C: תמונה ג'). בתאים שבהם הגן B היעד הושתק, פחות DJ1 translocates את המיטוכונדריה כאשר תאים נחשפים הרעלן. הדבר מצביע על כך הגן B היעד הוא מעורב להובלת DJ1 אל המיטוכונדריה. (BAR-B: תמונה B ו-BAR-D: D תמונה)

דוגמה של גן מעורב תולדה העצבית (איור 7): מציאה של C היעד גנים בר SH-SY5Y סוג התוצאות תאים לגידול משמעותי באורך neurite (BAR-B: image-B), לעומת תאים נגועים עם lentivirus להביע מקושקשות shRNA (בר: תמונה א '). אפקט זה הוא איבד בתאים מודגרות עם רעלן (BAR-C ו-D).

דוגמה של גן מעורב מורפולוגיה המיטוכונדריה (איור 8): זיהום של בר SH-SY5Y תאים סוג עם shRNA גן מיקוד תוצאות D לירידה בשווי SER-Ridge המיטוכונדריה פילוח (איור 8, תמונה C ו-D), כאשר בהשוואה ל תאים נגועים עם מקושקשות lentivirus (איור 8, תמונה A ו-B).

איור 1 מתאר פרוטוקול תא אוטומטיות תרבות.:

ntent ">
איור 2 סקירה סכמטי של תהליך המיון, ניתוח התמונה שיטות סטטיסטיות נעשה שימוש במהלך תהליך המיון:. I) הם תאים בתרבית עד שהם ומחוברות ו מצופה לאחר מכן לתוך צלחות assay המכיל את lentivirus shRNA. תאים הם מובחנים במשך 5 ימים ו הרעלן הוא הוסיף לאחר מכן את הצלחות למשך 24 שעות. צלחות Assay הם פלט מהמערכת immunostained. משך הזמן שנדרש לכל אחד התהליכים מצוין בסוגריים. ii) נתונים נרכש באמצעות imager HC (כדאיות התא, טרנסלוקציה חלבון תולדה נוירונים) ו imager אוטומטיות confocal (מורפולוגיה המיטוכונדריה). נתונים מיוצאים חבילת CellHTS2 בתוך R, בסיס (2) יומן טרנספורמציה מנורמל. דו כיוונית ANOVA משמש לזיהוי אינטראקציות משמעותיות בין משתנים שונים.

ילדה = "jove_content">
באיור 3. Composite תמונות של תאים נרכשה על ידי בג"צ הדמיה. א) בתאים שלא טופלו, ב) תאים שטופלו H ₂ O _2. DJ1 מסומן בירוק, המיטוכונדריה באדום הגרעינים בכחול. מכתים Neurite לא מסומן.

איור 4. כימות של תכונות הסלולר מספר המתקבלים HCS. לספירה) מטופל SH-SY5Y תאים. EH) H ₂ O ₂ שטופלו SH-SY5Y תאים. A, E) פילוח גרעינים ההגדרה של ROI, B, ו) זיהוי וכימות של המיטוכונדריה, ההחזר על ההשקעה ב: C, G) זיהוי DJ1, יעד הערוץ השני; D, G) זיהוי חישוב אורך neurite הממוצע. תאים קרוב לקצה של התמונה אינם נכללים בניתוח. תמונות הבלעה הם תמונות לפני ניתוח.

איור 5. זיהוי של גן ב epistasis עם DJ1 (אותיות על הסורגים מתאימות האותיות על התמונות). תמונות A עד D הם SH-SY5Y תאים שכותרתו עם Mitotracker CMXRos (אדום) ששימש כימות של בריאות התא.

איור 6. זיהוי של גן ויסות DJ1 טרנסלוקציה (אותיות על הסורגים מתאימות האותיות על התמונות). תמונות A עד D הם SH-SY5Y תאים שכותרתו עבור DJ1 (ירוק), מיטוכונדריה (אדום) גרעינים (כחול) ששימשו כימות של טרנסלוקציה DJ1 אל המיטוכונדריה.

איור 7. זיהוי של גנים המעורבים תולדה העצבית (אותיות על הסורגים מתאימות האותיות על התמונות). תמונות A עד D הם SH-SY5Y תאים שכותרתו עבור טובולין β-III (ירוק) גרעינים (כחול) אשר שימשו כימות אורך neurite.

איור 8. זיהוי של גנים המעורבים בוויסות מורפולוגיה המיטוכונדריה. תמונה A ו-C הם תמונות המשולב של SH-SY5Y תאים נגועים עם shRNA מקושקשות או מיקוד shRNA גן D בהתאמה. המיטוכונדריה הם בצבע אדום בעוד הגרעינים נצבעים בכחול. תמונה B ו-D הם חזותיים של כימות SER-רכס.

Discussion

עם הפחתת עלויות של HT / HC מערכות הסלולר ההקרנה, בשילוב עם הזמינות של הגנום כולו כלים חזקים כדי לשנות את תפקוד הגן, HT / HC המסכים הופכים דבר שבשגרה באקדמיה. הגישה כבר הותקן בהצלחה בתחומים מגוונים של מחקר כגון זיהוי של מטרות התרופה לסרטן ^{9, 31-33} ו - ^34-36 התפתחות עוברית ואפילו יש פוטנציאל ליישום בפענוח המסלולים המעורבים הפרעות נוירופסיכיאטריות ^37,38. עם זאת יישום של מערכת כזו דורשת השקעה משמעותית של זמן ומאמץ עם אופטימיזציה של תהליך לעתים קרובות לקחת מינימום של 6 חודשים. כל השלבים, כמו פעמים trypsinization, מהירויות pipetting וצפיפות זריעת צריך להיות מותאם, על מנת להבטיח כי תאים בריאים לצמוח בעקביות. מניעת זיהום חיידקי הוא אחד האתגרים הקשים ביותר מול תרבית תאים אוטומטית עם פרוטוקולי ניקוי שבועי גombination עם שטיפה מתמדת של כל הקווים נושאות נוזל עם 70% אתנול להיות הכרחי תרבויות זיהום בחינם. זה יהיה גם צורך לשפר את הרובוטיקה, כך מכשירים נוספים, כגון מיקרוסקופים confocal עבור רזולוציה גבוהה יותר ו -80 ° C מקפיאים לאחסון המתחם יכול להיות משולב.

יש גם מגבלות צורך לטפל על מנת לשפר את מהירות רגיש, השירות של שיטה זו ללמוד רשתות גנים ולזהות גנים המעורבים מסלולים מולקולריים פתוגניים.

כדי לנהל מסך HT / HC ולהבטיח כי נתונים אמינים נאסף, כמה היבטים צריך להיות מותאם. ראשית, אמינות המדידה היא מעל לכל תלוי חוסנו ואת הרגישות של assay. למשל, מבחני המתוארים לעיל מתאימים המסכים קטנים יותר, אבל קשה ליישם בקנה מידה רחב הגנום, בשל עיבוד מספר צעדים נדרשים לפני רכישת התמונה.לפיכך, אפשר היה לבנות שורות תאים יציבות לבטא את הגן הכתב, אשר יאפשר הדמיה ישירה להוביל וריאציה ירד בשל מספר מופחת של מדרגות עיבוד. נכון לעכשיו, תכנון assay מתאר במדויק ובאמינות מכמת פנוטיפ של עניין הוא צוואר הבקבוק העיקרי בתהליך המיון HC.

מסכי רבים שנערכו בתאי יונקים שונים באמצעות ספריות RNAi, אשר כולם סובלים מחוץ יעד אפקטים, יעילות מוגבלת להשתקת גנים בגנום כיסוי שלם. לפיכך ספריות צריך להתבצע אשר הם ספציפיים יותר, חזק ויש לי כיסוי טוב יותר. נערכים מאמצים ליצור כזה הוא קיווה במאמצים כזה ישפר את שחזור של HT / HC scre en להיטים.

הגבלה של רבים בקנה מידה גדול תא מסכי מבוססות כי הם נערכים בתאי נוירובלסטומה כי הם יכולים להיות מניפולציות גנטיות ותרבותי על מספרים גדולים בקלות יחסית. עם זאת, את הרלוונטיות של "להיטים" מזוהה לשעבר התרבות מודלים vivo תא בתפקוד vivo מוטלת בספק, במיוחד כאשר המוח מורכב של סוגי תאים מאוד מיוחדים אשר יוצרים רשת צפופה ומסובכת של קשרים סינפטיים לתפקד כיחידה משולבת מאוד. כתוצאה מכך, מקובל שפוגע מזוהה באמצעות גישה ההקרנה שתוארו לעיל, הן תוקף משני מסכי שימוש בטכניקות נוספות של מודלים רלוונטיים יותר פיזיולוגיים ^39. כדי לשפר את בתרגום של להיטים המזוהים במהלך HCS, נציג מודלים מתוחכמים יותר, כגון תאים ראשוניים התמיינות בתאי גזע או תרבות משותפת מערכות צריך להיות מפותחות המותאמות HT / HC גישות.

"ntent> עם שילוב של culturing תא אוטומטיות HC הדמיה אחד יכול במהירות לקבל תובנות חדשות על איך הנוירונים פונקציה ולקבוע אילו מסלולים חשובים להתפתחות המחלה. שילוב HCS / HTS נתונים עם מידע המופק גישות אחרות" omics ', זה יהיה אז ניתן יהיה לבנות סקירה מערכות הביולוגיה של מחלות במוח, ובכך להקל על התפתחות טיפולית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
AI.CELLHOST	המילטון	http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/
OPTI-ממ	Invitrogen	31985-054
Retinoic חומצה	Sigma-Aldrich	R2625
OMNITRAY צלחות	NUNC	465219
96 תרבות צלחות WELL	גרנייה	655086
DJ1 N20 נוגדן	סנטה קרוז	SC27004
BETA-III טובולין נוגדן	Sigma-Aldrich	T3952
MITOTRACKER CMXROS	Invitrogen	M-7512
Hoechst-33342	Invitrogen	H1399
מי חמצן	Sigma-Aldrich	216,763, 100 מ"ל
טריפסין	Invitrogen	25050014
פוספט'S DULBECCO בופר	Invitrogen	14190086
PROMEGA אשף MAGNESIL TFX	PROMEGA	A2380
SHRNA שיבוטים	OPEN BioSystems	http://www.openbiosystems.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails /
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS	תרמו פישר	http://www.thermo.com/hcs