عزل الخلايا القاعدية والخلايا تحت المخاطية قناة الغدة من القصبة الهوائية ماوس

Summary

هنا علينا أن نبرهن بروتوكول لدينا لعزل الخلايا القاعدية وتحت المخاطية قناة الغدة من القصبات الماوس. علينا أن نبرهن أيضا طريقة حقن الخلايا الجذعية في لوحة الماوس الدهون الظهرية لإنشاء في الجسم الحي نموذج للتجديد الغدة تحت المخاطية.

Abstract

الشعب الهوائية الكبيرة على اتصال مباشر مع البيئة وبالتالي عرضة للإصابة من السموم والعوامل المعدية أننا في التنفس ^1. الشعب الهوائية الكبيرة تتطلب بالتالي إصلاح آلية فعالة لحماية أجسامنا. هذه العملية يحدث إصلاح من الخلايا الجذعية في الشعب الهوائية وعزل هذه الخلايا الجذعية من الشعب الهوائية من المهم لفهم آليات الإصلاح والتجديد. من المهم أيضا لفهم إصلاح الشاذة التي يمكن أن تؤدي إلى أمراض الشعب الهوائية ^2. والهدف من هذا الأسلوب هو لعزل الخلايا الجذعية من رواية سكان القصبة الهوائية الماوس القنوات الغدة تحت المخاطية ووضع هذه الخلايا في المختبر في وأنظمة نموذج الجسم الحي للتعرف على آليات إصلاح وتجديد الغدد تحت المخاطية ^3. يظهر هذا الإنتاج الأساليب التي يمكن استخدامها لعزل وفحص الخلايا الجذعية لاصق والقاعدية من الشعب الهوائية كبيرة ^3، مما سيسمح لنالدراسة أمراض الشعب الهوائية، مثل التليف الكيسي، الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. حاليا، لا توجد طرق لعزل خلايا الغدة تحت المخاطية القناة وليس هناك أي نماذج في الجسم الحي لدراسة تجديد الغدد تحت المخاطية.

Protocol

الخطوط العريضة للخطوات

1. تشريح القصبة الهوائية

2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه

3. انزيم الهضم ومعالجة في التعليق خلية واحدة

4. لتلطيخ FACS والفرز

5. معالجة الخلايا في الجسم الحي لفرز ونماذج في المختبر

1. تشريح القصبة الهوائية

1. الموت ببطء الماوس مع حقنة داخل الصفاق من نسخة 0.1 من mg/0.2 بنتوباربيتال.
2. خفض فتح جدار البطن، ونقل إلى الجانب الأمعاء لفضح الشريان الأورطي البطني ومن ثم تشريح ذلك.
3. فتح الصدر عن طريق قطع من خلال الحجاب الحاجز وجدار الصدر الأمامي على جانبي لفضح القلب والرئتين. مواصلة قطع يصل الى الرقبة إزالة الغدد اللعابية والدهون لفضح القصبة الهوائية.
4. إزالة الغدة الصعترية وقطع الرئة من اتصالات إلى ما دون وراء. Separيأكلون من القصبة الهوائية والمريء عن طريق إدراج ملقط بينهما ثم قطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي من معظم أعلاه اتصاله مع الحنجرة. ثم عقد القصبة الهوائية مع ملقط تشريح وذلك من حرصه ومواصلة الهبوط لإزالته مع القلب والرئة EN-كتلة. قطع القلب والرئتين بالقرب من نقير لتشمل معظم الشعب الهوائية الرئيسية اليمنى واليسرى.
5. وضع القصبة الهوائية في طبق بتري صغيرة تحتوي على جمع المتوسطة على الجليد.

2. تنظيف القصبة الهوائية وقطع عليه

1. تحت المجهر تشريح، واستخدام ملقط نقطة دقيقة جدا (رقم 5) ومقص Vannas توبنجن (FST 15003-08 finescience.com) لتنظيف القصبة الهوائية من أنسجة سائر المرتبطة به. وهذا يشمل: الغدد الليمفاوية، العصب الحنجري المتكررة، والدهون والغدة الدرقية والأوعية الرئوية المتبقية. الجزء العلوي من القصبة الهوائية يحتاج إلى عناية خاصة، لإزالة غضاريف الحنجرة كبيرة دون المساس أكبر مجموعة من SMGوقدمت بين أن الغضروف الحلقي، وأول حلقة الغضروفية القصبة الهوائية (C1) ^4.
2. قطع القصبة الهوائية في الجزء العلوي والجزء السفلي بين C4 C5 وفوق فتح وقطع كل أجزاء من خلال تجويف القصبة الهوائية.

3. انزيم الهضم ومعالجة في تعليق خلية واحدة (SCS)

1. احتضان الجزء السفلي من القصبة الهوائية في 1 مل من dispase U 16 في أنبوب إيبندورف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة، كما هو موضح سابقا ^5. ثم يضاف 0.5 ملغ / مل الدناز I في DMEM ل20 دقيقة إضافية في RT.
2. إزالة القصبات هضمها في جمع الطازجة المتوسطة في طبق بتري معقمة، وتجريد ظهارة السطح تحت المجهر تشريح. استخدام ماصة لنقل متوسطة تحتوي على ظهارة جردت إلى أنبوب 50 مل المخروطية.
3. تدور أسفل ظهارة جردت في 1،000 XG في C. ° 4 إزالة طاف، وإضافة 0.1٪ التربسين / EDTA واحتضان بينما تهز الأنبوب ه في 37 ° C تهز الحاضنة (200 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وذلك باستخدام معلومات سرية ميكرولتر 1000، ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل وتشكيل التعليق خلية واحدة.
4. وضع القصبة الهوائية العليا في أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل من pronase 0.15٪. ثم في احتضان C ° 4 لمدة 4 ساعة.
5. دوامة بلطف ثم ضع أنبوب القصبة الهوائية في جمع الطازجة والمتوسطة تأكيد تشريح تحت المجهر أن هناك حياد تام للظهارة السطحية (SE).
6. اللحم المفروم القصبة الهوائية مع غرامة مقص لفتح حجرات SMG ومن ثم احتضان لمدة ساعة في أكثر pronase في RT مع اهتزاز بطيء.
7. تدور القصبة الهوائية أسفل الأنسجة، وإزالة pronase، إضافة 0.1٪ التربسين / EDTA واحتضان في C ° 37 لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز على النحو الوارد أعلاه.
8. مرور الخلايا هضمها، وكتل أي قطع ما تبقى من الغدد عن طريق الإبر 20G، 23G 26G وباستخدام حقنة 10 مل. كرر مرات عدة مع كل الركض حجم الإبرة قبلتنحيه. الآن، ينبغي أن تكون معظم الخلايا في SCS.
9. تصفية التعليق من خلال مصفاة ميكرومتر 40 ثم يغسل مصفاة وتدور أسفل الخلايا. ثم إعادة الخلايا في حجم مناسب من المتوسطة، عد الخلايا والشروع فورا في FACS تلطيخ والفرز. لا تترك الخلايا في C ° 4 أو على الجليد لعدة ساعات لأننا وجدنا أن هذا يؤثر على سلامة ويقلل كثيرا من كفاءة المجال تشكيل.

4. لتلطيخ FACS والفرز

1. أخذ خلايا كافية للإعداد غير ملوثين واحد أنابيب التعويض الملون وصمة عار ثم بقية الخلايا مع أجسام مضادة الأولية، Trop2 الماعز والفئران ITGA6، لمدة 15 دقيقة في RT. ثم تغسل مع PBS أو جمع المتوسطة، مزيل طاف بعناية فائقة وكسر بيليه الخلية.
2. وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، احتضان في الظلام في RT لمدة 10 دقيقة، وغسل وإزالة طاف وكسر ثم بيليه.
3. على FACSARIA، بعد تعديل الجهد الخاص والتعويض، من بوابة الانقاض، وخلايا صغيرة جدا، والحلل الخلية الخلايا الميتة. ثم، ينبغي أن معظم الخلايا من تكون SE TROP2 إيجابية بينما 20-50٪ من الخلايا SMG سيكون TROP2 + ^6.
4. تعيين البوابة الخاص بك لفرز Trop2 + + الخلايا من ITGA6 SE (الخلايا القاعدية) وTrop2 + الخلايا (+ /-ITGA6 خلايا إيجابية) من SMG (خلايا القناة).

5. تجهيز خلايا الترتيب ل: في المختبر الثقافة والموديل في الجسم الحي

5.1 في مجال المختبر تشكيل الثقافة ^5-9

1. "خفض عامل نمو Matrigel" مزيج من 100 ميكرولتر مع 100 ميكرولتر من المتوسطة ^10،11 كاملة (انظر الجدول 1) التي تحتوي على ما يصل الى 50،000 الخلايا مصنفة ثم وضع هذا الخليط في مجلس الشيوخ من بئر العابر 24 أيضا. وضع ثم 400 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في مجلس النواب واحتضان عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في مجلس النواب كل يوم إضافي وإضافة 100 ميكرولتر من Matrigelكل أسبوع أو قبل ذلك إذا أصبحت رقيقة.

5.2 في نموذج الجسم الحي

1. إعادة فرز الخلية بيليه في المتوسط ​​كاملة مختلطة 1:1 مع matrigel بتركيز 5،000-10،000 الخلايا في 50 ميكرولتر.
2. تخدير المتلقي C57/BL6 الفئران. إدارة كاربروفين (5 ملغ / كلغ) subcutaenously بمثابة مسكن. تعقيم ويحلق ظهورهم ثم إجراء شق الجلد المركزية طولية في الجزء الأعلى من الظهر. ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي شق لتحديد موقع الدهون حقن سادة فضلا عن فقاعة تشكل بعد الحقن. استخدام الجانب حادة من مقص لتوسيع الحقائب بين الجلد والخلفي من جدار الصدر من الجانبين لتحقيق أقصى قدر من الوصول والتصور.
3. تحديد الحدود وسطي للكتف عن طريق دفع forelimb الماوس لأعلى والخلف لرؤية الحركة لوح الكتف. تأخذ 50 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى 300 ميكرولتر BD حقنة الانسولين وحقنه في لوحة الدهون الإنسي عادل للكتف والجانبية لالفقرات. يجب أن تكون قادرا على رؤية فقاعة خلاف ذلك كنت عميقة جدا. تكرار نفسه على الجانب الآخر مقطع أو غرزة ثم شق الجلد. تحقق الفئران وإعطاء كاربروفين (5 ملغ / كغ، SC) مرة واحدة يوميا لمدة 48 ساعة.
4. بعد 3 أسابيع، الموت ببطء مع الفئران pentobarbatol (0.1 mg/0.2 سم مكعب، IP)، فتح الجلد على النحو الوارد أعلاه وتشريح كامل لوحة الدهون من الجانبين مع هامش أمان لتجنب فقدان أي بنية الأنسجة التي ربما شكلت وتمديد حولها. إصلاح في PFA والبارافين في تضمين ^12. ينبغي استخدام الحذر الشديد أثناء تقليم وقطع كتلة عدم تجاوز أو تجاهل هيكل. أفضل الممارسات لخفض 40 ميكرون ثم مرة واحدة قطع شريحة ميكرون 4، ضعه على شريحة زجاجية وفحصها تحت المجهر للتأكد إذا كان هناك أي "هياكل الظهارية" في هذا الجزء من كتلة أم لا. إذا كان هناك أي شيء ينظر إليه، ثم خفض مرة أخرى وكرر هذه الخطوة.

6. ممثل النتائج

يتوسوف pping من القصبات الماوس يؤدي إلى القصبة الهوائية المعري التي مرئيا بواسطة المجهر الضوئي كما هو موضح في الشكل 1A. 1B الشكل يبين وجهة النظر brightfield من القصبة الهوائية بعد تجريد الظهارية مع الغدد تحت المخاطية الإفراج عنه من الأنسجة وباقات تشبه العنب.

Pronase يزيل حاتمة ITGA6 وهذا هو السبب في أن الخلايا لا يمكن فصلها TROP2 القناة في ITGA6 + و- السكان. ومع ذلك، dispase، الذي يحافظ على حاتمة ITGA6، يساعد على هضم جميع ظهارة السطحية وخلايا القناة حتى مع أوقات حضانة قصيرة جدا، وبالتالي لا يمكن استخدامها لفصل الخلايا القاعدية من القناة ^3. يجب التدفق الخلوي للتعليق خلية واحدة إلى الأمام تظهر المخططات مبعثر مبعثر والجانبية التي تتمثل في الشكل 2A. فصل الخلايا جيدة القناة عن بقية ما إذا كان ينبغي أن ينظر إلى الخلايا القصبة الهوائية مع الأجسام المضادة Trop2 في التدفق الخلوي لخلية المنشط الفلورسنت sortiنانوغرام (FACS) كما رأينا في الشكل 2B. يجب أن تكون مرئية المجالات في matrigel بعد حوالي 1 أسبوع في الثقافة وكثيفة في المظهر كما هو موضح في الشكل 3. كفاءة هذه العملية هو أمر 1-2٪ والخلايا واحدة ستظل موجودة في matrigel وتمثل الخلايا من المحتمل القنوات الغدة تحت المخاطية التي لا تمتلك القدرة على التجديد الذاتي. حقن الخلايا الجذعية لاصق في نتائج لوحة الماوس الدهون في تشكيل هياكل تشبه الغدد تحت المخاطية التي تظهر الشكل 4. وينظر في هذه الكتل حتى من دون تلطيخ H & E. هذه هي كروية ويمتلك التجويف المركزي. العديد من المقاطع العرضية يجب القيام بها من خلال لوحة الدهون حتى لا تفوت هذه الهياكل الظهارية.

الشكل 1. الهضم الإنزيمي للظهارة القصبة الهوائية. ويرد إزالة الخلايا الظهارية السطحية مع BLACويرد السهام ك، وإزالة الخلايا في القنوات الغدة تحت المخاطية مع السهام الخضراء. وتظهر القصبات المعري التي تكون مرئية بواسطة المجهر الضوئي بعد 30 دقيقة من عملية الهضم dispase وبعد 4 ساعات من الهضم pronase.

2A الرقم الأول. التدفق الخلوي للتعليق خلية واحدة إلى الأمام تظهر مبعثر ممثل والمخططات مبعثر الجانب من القصبات الماوس بعد تجريد سطح الظهارية. الثاني. ممثل FACS المؤامرات لTROP2 التعبير في الخلايا القناة من القصبات الماوس.

2B الرقم الأول. التدفق الخلوي للخلية واحدة من المعلقات ظهارة سطح جردت من ثلثي أقل اثنين من القصبة الهوائية الماوس تظهر مبعثر إلى الأمام وممثل الجانب مبعثر المؤامرات. الثاني. FACS نموذجية قطعة ITGA6 التعبير في سوrface ظهارة. ثالثا. آخر مؤامرة FACS ممثل الأمام والجانب مبعثر من ظهارة السطح مرة أخرى تظهر النابضة من السكان الخلايا القاعدية باللون الأخضر. رابعا. ITGA6 النموذجية وTROP2 معربا عن السكان الخلية باللون الأخضر.

الشكل 3. بالطبع وقت تطوير المجالات. A. المجالات لاصق. يجب أن تكون مرئية المجالات في matrigel بعد حوالي 1 أسبوع في الثقافة وتقريبا جميع كثيفة في المظهر. وينظر أيضا خلايا مفردة التي لا تشكل المجالات. (شريط النطاق = 50 ميكرون). B. المجالات بصل أكبر واللمعية في المظهر. وينظر أيضا خلايا مفردة التي لا تشكل المجالات. (شريط النطاق = 50 ميكرون).

الشكل 4. حقن الخلايا الجذعية لاصق في نتائج لوحة الماوس الدهون في تشكيل هياكل تشبه الغدد تحت المخاطية. ممثل الهياكلوتظهر في لوحة الدهون وتظهر بعض انتاج الميوسين (الضوء الأزرق) مع زرقة الألسيان شيف حمض الدوري وصمة عار.

Discussion

هذه التقنية لعزل الخلايا القاعدية والقناة من الشعب الهوائية من المهم لتحسين فهمنا للإصلاح والتجديد الهوائية وأمراض الشعب الهوائية. التقنيات الموضحة هنا تشمل على بعد خطوات قليلة حرجة. الأول هو الأمثل فترة الهضم الأنزيمي. والثاني هو إنشاء خلية واحدة من خلال التعليق ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
استكمال المتوسطة 10: DMEM-F-12، 50/50، 1X)	Mediatech	15-090-CV
HEPES (15 ملم)	إينفيتروجن	15630
بيكربونات الصوديوم (3.6mM أو 0.03٪)	إينفيتروجن	25080
الجلوتامين L-(4 ملم)	Mediatech	25-005-الكلورين
البنسلين (100 U / مل)	Mediatech	30-001-CI
الستربتوميسين (100 ميكروغرام / م)	Mediatech	30-001-CI
الأمفوتريسين B (0.25 ميكروغرام / مل)	Lonza	17-836R
فيsulin (10 ميكروغرام / مل)	سيجما	I6634
ترانسفيرين (5 ميكروغرام / مل)	سيجما	T1147
بكتيريا الكوليرا (0.1 ميكروغرام / مل)	سيجما	C8052
عامل نمو البشرة (25 نانوغرام / مل)	BD	354001
النخامية البقري استخراج (30 ميكروغرام / مل)	إينفيتروجن	13028-014
المصل البقري الجنين (5٪)	الصياد	SH3008803HI
حمض الريتينويك (0.05 ميكرومتر)	سيجما	R2625
انخفاض عامل النمو Matrigel	BD	354230

اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
Pronase	روش	10165921001	تستخدم في 0.15٪: -O / N عند 4 ° C الهضم لعزل خلايا القصبة الهوائية الإجمالي (ALI للثقافة) -4 ساعة الهضم 4 ° C لعزل SMG
Dispase	BD العلوم البيولوجية	354235	استخدام وحدات في 16: 30 دقيقة في RT
الدناز I	سيجما	DN25	تستخدم عند 0.5 ملغ / مل: 20-30 دقيقة في RT