Изоляция базальных клеток и подслизистой Клетки Канальные железы от трахеи мыши

Резюме

Здесь мы демонстрируем наш протокол для выделения базальной и подслизистого железы воздуховодов клетки из мышиных трахеи. Мы также продемонстрировать метод инъекционного стволовых клеток в спинной панели жира мыши, чтобы создать В естественных условиях Модель подслизистого регенерации железы.

Аннотация

Большая дыхательных путей непосредственно в контакте с окружающей средой и, следовательно, подвержены травмам от токсинов и инфекционных агентов, которые мы дышим в ^1. Большая дыхательных путей, следовательно, требуют эффективного механизма ремонт защитить наш организм. Этот процесс восстановления происходит из стволовых клеток в дыхательных путях и выделения стволовых клеток из дыхательных путей имеет важное значение для понимания механизмов восстановления и регенерации. Это также важно для понимания ненормального ремонт, который может привести к заболеваниям дыхательных путей ^2. Цель этого метода заключается в изоляции роман популяции стволовых клеток из мышей трахеи подслизистого протоки железы и разместить эти клетки в пробирке и в естественных системах модель для определения механизма ремонт и восстановление подслизистых желез ^3. Это производство показывает методы, которые могут быть использованы для выделения и анализа канала и базальных стволовых клеток из больших дыхательных путей ^3. Это позволит намдля изучения заболеваний дыхательных путей, таких как муковисцидоз, бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких. В настоящее время не существует методов для выделения подслизистых желез канала клетки и нет в естественных моделей для изучения регенерации подслизистых желез.

протокол

План шаги

1. Вскрытие трахеи

2. Очистка трахеи и резко его

3. Ферменты пищеварения и переработки в суспензии отдельных клеток

4. Окрашивание для FACS и сортировки

5. Обработка отсортированных клеток в естественных условиях и в пробирке моделей

1. Вскрытие трахеи

1. Усыпить мыши с внутрибрюшинной инъекции 0,1 мл mg/0.2 пентобарбитала.
2. Разрезать брюшной стенки, и двигаться кишечник в сторону, чтобы разоблачить брюшной аорты, а затем вскрыть его.
3. Откройте сундук, сокращая через диафрагму и передней грудной стенки с обеих сторон, чтобы открыть сердце и легкие. Продолжайте резать в шею удаления жира и слюнных желез, чтобы разоблачить трахеи.
4. Удалить тимуса и сократить легких от его соединения ниже и сзади. Separели трахеи с пищеводом, вставив между ними щипцы затем разрезать трахею в ее верхней части над самым его связь с гортанью. Затем, удерживая трахеи с щипцами и анализировать его от привязанности и продолжают вниз, чтобы удалить его с сердца и легких ан-блок. Вырежьте сердце и легкие рядом с рубчиком, чтобы включить большую часть правого и левого главных бронхов.
5. Поместите трахеи в небольшой чашке Петри содержащие накопительной среды на льду.

2. Очистка трахеи и резко его

1. Под микроскопом рассечение, используйте очень тонкий момент щипцами (№ 5) и Vannas Тюбингена ножницы (ФСТ 15003-08 finescience.com) для очистки трахеи от всех других тканей прилагается к нему. Это включает в себя: лимфатические узлы, возвратный гортанный нерв, жиров, щитовидной железы и остальных легочных сосудов. В верхней части трахеи требует особого внимания, для удаления больших хрящей гортани без ущерба для крупнейших кучу SMG, которые подали между хрящом перстневидного и первый трахеи хрящевой кольца (C1) ^4.
2. Вырезать трахеи в верхней части и нижней части между С4 и С5, а затем разрезать обе части через просвет трахеи.

3. Пищеварение фермента и обработки в суспензии отдельных клеток (SCS)

1. Инкубируйте нижней части трахеи в 1 мл 16 U диспазы в трубку Eppendorf при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин, как описано выше ^5. Затем добавить 0,5 мг / мл ДНКазы I в DMEM в течение дополнительных 20 минут при комнатной температуре.
2. Снимите переваривается трахеи на свежий сбор среду в стерильные чашки Петри, и лишить поверхности эпителия под рассекает микроскопом. С помощью пипетки перенести среде, содержащей лишен эпителия в 50 мл коническую трубку.
3. Спином вниз лишен эпителия при 1000 мкг при 4 ° C. Удалить супернатант и добавить 0,1% трипсина / ЭДТА и инкубируют при встряхивании йэлектронной трубы в 37 ° С инкубатор (200 оборотов в минуту) в течение 30 мин. После инкубации, используя 1.000 мкл наконечник, пипетки вверх и вниз, чтобы разбить скопления и образуют единую клеточной суспензии.
4. Установите верхний трахеи в коническую пробирку, содержащую 1 мл 0,15% проназа. Затем инкубировали при 4 ° С в течение 4 часов.
5. Аккуратно вихревой трубки, а затем поместить в трахею в свежей среде, сбор и подтвердить под рассекает микроскопом, что есть полный отрыв от поверхности эпителия (SE).
6. Фарш трахеи с тонкой ножницы, чтобы открыть SMG отсеков, а затем инкубировать в течение еще одного часа при комнатной температуре проназа с медленным встряхивании.
7. Спином вниз трахеи ткани, удалить проназа, добавить 0,1% трипсина / ЭДТА и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин при встряхивании, как указано выше.
8. Прохождение усваивается клетками, скопления и все оставшиеся куски желез через 20G, 23G и 26G иглы с помощью 10 мл шприца. Повторите пассажи несколько раз с каждой иглы размером доуйти в отставку. Теперь, большинство клеток должно быть в SCS.
9. Фильтр суспензии через 40 мкм фильтр затем промыть фильтр и спином вниз клетки. Тогда восстановить клетки в соответствующих объемов среды, рассчитывать клеток и немедленно приступить к FACS окрашивания и сортировки. Не оставляйте клеток в 4 ° C или на льду в течение нескольких часов, потому что мы обнаружили, что это влияет на жизнеспособность и существенно снижает сферу формирования эффективности.

4. Окрашивание для FACS и сортировка

1. Возьмите достаточное количество клеток для подготовки неокрашенных и окрашенных одной трубы компенсации, то пятно остальной части клетки с первичными антителами, козы Trop2 и крысы ITGA6, в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем промыть водой с PBS или сбора среду, удаления супернатанта очень тщательно и нарушают клеточный осадок.
2. Пятно с соответствующими вторичными антителами, инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин, промыть и удалить супернатант, а затем разорвать гранул.
3. На FACSARIA, после изменения настроек напряжения и компенсации, ворота из мусора, очень маленькие клетки, клетки дублетов и мертвых клеток. Тогда, большинство клеток от SE должно быть положительным TROP2 в то время как 20-50% SMG клетки будут TROP2 + ^6.
4. Установить сортировку ворота для Trop2 ITGA6 + + клеток от SE (базальные клетки) и Trop2 + клеток (+ /-ITGA6 положительных клеток) от SMG (канал клеток).

5. Обработка Упорядочить Клетки для: экстракорпоральное культуры и в естественных условиях модели

5.1 В пробирке сфере формирования культуры ^5-9

1. Смешать 100 мкл "Фактор Роста уменьшить Matrigel" со 100 мкл полной среды ^10,11 (см. Таблицу 1), содержащее до 50.000 отсортированных клеток затем положить эту смесь в верхней палате 24-и транс-а. Затем положить 400 мкл полной среды в нижнюю палату и инкубировать при температуре 37 ° C. Изменение среды в нижней палате каждый день и добавить дополнительные 100 мкл MatrigelКаждую неделю или раньше, если он становится тонким.

5.2 В модели естественных условиях

1. Развести отсортированы осадок клеток в полной среде смешать 1:1 с матригель в концентрации 5,000-10,000 клеток в 50 мкл.
2. Anesthetize получателя C57/BL6 мышей. Администрирование Carprofen (5 мг / кг) subcutaenously как анальгетик. Стерилизовать и брить их спинами затем сделать центральный продольный разрез кожи в верхней части спины. Разрез должен быть достаточно большим, чтобы определить место инъекции жира площадки, а также волдырь, которая формируется после инъекции. Используйте тупой стороной ножниц, чтобы расширить пакеты между кожей и задней стенки грудной клетки с обеих сторон для максимального доступа и визуализации.
3. Определить медиальный край лопатки нажатием мыши лапы вверх и назад, чтобы увидеть движущиеся лопатки. Принимать по 50 мкл суспензии клеток в 300 мкл шприц инсулина BD, и внедрить его в жировой ткани только медиальнее лопатки и сбокупозвонков. Вы должны быть в состоянии видеть пузырь в противном случае вы слишком глубоко. Повторите то же самое с другой стороны, то клип или сшить разрез кожи. Проверьте мышей и дать Carprofen (5 мг / кг, SC) один раз в сутки в течение 48 часов.
4. Через 3 недели, усыпить мышей с pentobarbatol (0,1 mg/0.2 куб.см, IP), откройте кожи, как указано выше и анализировать весь жировой ткани с обеих сторон с запасом, чтобы не пропустить любую ткань структуры, которые могли образоваться и расширен вокруг. Исправить в PFA и вставлять в парафин ^12. Особая осторожность должна быть использована во время обрезки и резки блоков не обойти или игнорировать структуру. Лучше всего обрезать 40 мкм один раз, затем вырезать 4 мкм кусочек, положите его на стекло и рассмотреть его под микроскопом, чтобы подтвердить, есть ли "эпителиальных структур" в этой части блока или нет. Если ничего не видел, то обрезать еще раз и повторите этот шаг.

6. Представитель Результаты

Stripping из трахеи мыши приведет к оголенный трахею, которая видна с помощью световой микроскопии, как показано на рисунке 1а. рис. 1б показывает светлое зрения трахеи после удаления эпителия с подслизистых желез освобождения из ткани, напоминающие гроздья винограда.

Проназа удаляет ITGA6 эпитопов, и именно поэтому TROP2 канала клетки не могут быть разделены на ITGA6 + и - население. Тем не менее, диспазы, которая сохраняет ITGA6 эпитопов, переваривает все поверхности эпителия и канал клеток даже при очень коротком времени инкубации, и поэтому не может быть использован для разделения канала из базальных клеток ^3. Проточной цитометрии единого клеточные суспензии должна показать рассеяния вперед и боковой разброс участков, которые представлены на рисунке 2А. Хорошее разделение канала клетки от остальных, если трахеи клетки следует рассматривать с Trop2 антител в проточной цитометрии для люминесцентных клеток, активированных сортировонг (FACS), как показано на рисунке 2B. Сферы должны быть видны в матригель примерно через 1 неделю в области культуры и плотны на вид, как показано на рисунке 3. Эффективность этого процесса порядка 1-2%, а отдельные клетки будут присутствовать в матригель и, вероятно, представляют собой клетки из протоков подслизистых желез, которые не обладают способностью к самообновлению. Инъекции канал стволовых клеток в мышь жира результаты площадку в формировании подслизистых желез-подобные структуры, показана на рисунке 4. Они видели в блоках даже без окрашивания H & E. Они имеют сферическую форму и обладают центральным просветом. Многие сечения должны быть сделаны через жировой ткани, чтобы не пропустить эти эпителиальных структур.

Рисунок 1. Ферментативного расщепления трахеи эпителия. Удаление поверхностных эпителиальных клеток показано с BlacА стрелки, удаление клеток в протоках железы подслизистого показан зелеными стрелками. Оголенные трахеи, которые видны с помощью световой микроскопии показано через 30 мин диспазы пищеварения и через 4 часа проназы пищеварения.

Рисунок 2А. Я. Проточной цитометрии единого клеточные суспензии показывать представитель рассеяния вперед и участков сторону разброс от мыши трахеи после удаления поверхностного эпителия. II. Представитель участков FACS для TROP2 выражение в воздуховоде клетки из мышиных трахеи.

Рисунок 2B. Я. Проточной цитометрии единого клеточные суспензии из лишили поверхности эпителия нижних двух третей трахеи мыши показывать представитель рассеяния вперед и участков сторону разброс. II. Типичный сюжет FACS из ITGA6 выражение в суrface эпителия. III. Другой представитель участок FACS переднего и бокового рассеяния от поверхности эпителия показывает обратно стробирования базальной клеточной популяции в зеленый цвет. внутривенно Типичные ITGA6 и TROP2 выражения клеточной популяции в зеленый цвет.

Рисунок 3. Время хода развития сфер. А. Канальные сферах. Сферы должны быть видны в матригель примерно через 1 неделю в области культуры и почти все они плотны на вид. Отдельные клетки, которые не образуют сферы также видели. (Шкалы = 50 мкм). B. Базальная сферы большего просвета и по внешнему виду. Отдельные клетки, которые не образуют сферы также видели. (Шкалы = 50 мкм).

Рисунок 4. Инъекции канал стволовых клеток в мышь жира результаты площадку в формировании подслизистых желез-подобные структуры. Представитель структурприведены в жировой ткани и некоторые из них показали производство муцина (светло-синий) с Alcian синие периодическому Шифф кислота пятна.

Обсуждение

Этот метод, чтобы изолировать воздуховод и базальных клеток из дыхательных путей имеет важное значение для улучшения нашего понимания ремонт дыхательных путей и регенерацию и заболеваний дыхательных путей. Методы, описанные здесь, включают в себя несколько важных этапов. Во-первых, э?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Полной среде 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X)	Mediatech	15-090-CV
Hepes (15 мм)	Invitrogen	15630
Бикарбонат натрия (3,6 мм или 0,03%)	Invitrogen	25080
L-глютамин (4 мм)	Mediatech	25-005-Cl
Пенициллина (100 ед / мл)	Mediatech	30-001-ДИ
Стрептомицин (100 мкг / м)	Mediatech	30-001-ДИ
Амфотерицин (0,25 мкг / мл)	Lonza	17-836R
Винсулина (10 мкг / мл)	Сигма	I6634
Трансферрина (5 мкг / мл)	Сигма	T1147
Холера токсина (0,1 мкг / мл)	Сигма	C8052
Эпидермального фактора роста (25 нг / мл)	BD	354001
Бычий гипофизарный экстракт (30 мкг / мл)	Invitrogen	13028-014
Эмбриональной телячьей сыворотки (5%)	Рыбак	SH3008803HI
Ретиноевая кислота (0,05 мкм)	Сигма	R2625
Фактор роста Снижение Matrigel	BD	354230

Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Проназа	Roche	10165921001	Используется на 0,15%: -O / N при 4 ° С пищеварением, чтобы изолировать общего трахеи клетки (для культуры ALI) -4 Пищеварения час 4 ° C, чтобы изолировать SMG
Диспазы	BD Biosciences	354235	Используется на 16 единиц: 30 минут при комнатной температуре
ДНКазы I	Сигма	DN25	Применяется при 0,5 мг / мл: 20-30 минут при комнатной температуре