عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Summary

نقدم نهج ميكروفلويديك للتعبير عن المصفوفات البروتين. الجهاز يتكون من آلاف من الدوائر التي تسيطر عليها رد فعل الصغيرة الميكانيكية الصمامات. تزاوج الجهاز ميكروفلويديك إلى مكتبة الجينات ميكروأري المطبوعة. وكتب بعد ذلك هذه الجينات وترجمتها على الرقاقة، مما أدى إلى مجموعة البروتين جاهزة للاستخدام التجريبي.

Abstract

الحقول يتزايد بسرعة، مثل علم الأحياء النظم، تتطلب وضع وتنفيذ تكنولوجيات جديدة، وتمكين قياسات عالية الإنتاجية وارتفاع الإخلاص، نظم كبيرة. على microfluidics وعود لتحقيق العديد من هذه المتطلبات، مثل إجراء التجارب الفرز الفائق الإنتاجية على الرقاقة، والتي تشمل فحوصات الكيمياء الحيوية، والفيزياء الحيوية، ومقرها ^{الخلية-1.} منذ الأيام الأولى من أجهزة على microfluidics، وقد تطورت بشكل كبير هذا المجال، مما يؤدي إلى تطوير التكامل على نطاق واسع ميكروفلويديك ^2،3. هذه التكنولوجيا تسمح لإدماج الآلاف من الصمامات الميكرو ميكانيكية على جهاز واحد مع بصمة البريد الحجم (الشكل 1). قمنا بتطوير منصة عالية الإنتاجية لتوليد ميكروفلويديك في المختبر من صفائف التعبير البروتين (الشكل 2) اسمه PING (مولد الشبكة بروتين التفاعل). يمكن لهذه المصفوفات تخدم كنموذج لتجارب العديد منمثل البروتين البروتين ^4، البروتين RNA ⁵ أو ⁶ DNA البروتين التفاعلات.

الجهاز يتكون من آلاف من غرف رد فعل، والتي مبرمجة بشكل فردي باستخدام microarrayer. التوفيق بين هذه المطبوعة إلى ميكروأرس برامج الأجهزة على microfluidics كل غرفة مع بقعة واحدة القضاء على التلوث المحتملة أو عبر التفاعل-علاوة على ذلك، باستخدام تقنيات توليد ميكروأرس ميكروأري القياسية اكتشاف هو أيضا وحدات للغاية، مما يسمح للarraying من البروتينات ^7، DNA ^8، جزيئات صغيرة، والمعلقات حتى الغروية. الأثر المحتمل للعلوم البيولوجية على microfluidics على أمر مهم. وقد قدم عدد من فحوصات على microfluidics القائمة بالفعل رؤى جديدة في هيكل ووظيفة النظم البيولوجية، وميدان على microfluidics سوف تظل تؤثر البيولوجيا.

Protocol

1. جهاز التصنيع

1. اشترى DTPA SU-D-8 العفن والعفن تحكم SPR220-7 من تدفق الموائع الدقيقة microfluidics مسبك ستانفورد ( www.stanford.edu / مجموعة / مسبك ).
2. كشف قوالب سيليكون لchlorotrimethylsilane (TMCS) بخار لمدة 10 دقيقة لتعزيز الافراج الاستومر بعد خطوات الخبز ^9.
3. إعداد خليط من المطاط الصناعي السيليكون القائم وكيل علاج (تخلط جيدا) في اثنين من نسب مختلفة 05:01 و 20:1 لمراقبة وقوالب تدفق على التوالي. نسب مختلفة ضرورية للترابط السليم لطبقات متعددة.
4. صب PDMS 05:01 على طبقة التحكم (حوالي 5 مم الارتفاع). ديغا طبقة تحكم وخبز لمدة 30 دقيقة في 80 ° C. معطف زيادة ونقصان (Laurell، الولايات المتحدة الأمريكية) الخليط PDMS 20:01 على طبقة تدفق في 2600 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية ثم خبز في C ° 80 لمدة 30 دقيقة. تم تحسين سرعة الدوران المغطي ليشتغل عند ضغط صماممن 15 رطل لكل بوصة مربعة. وأسرع الغزل يؤدي إلى أرق طبقة مع انخفاض ضغط تفعيل والعكس بالعكس. الأجهزة التي نستخدمها يكون حد 25 رطل لكل بوصة مربعة في السيطرة والمبادرة 10 في التدفق، وأعلاه والتي مفرزة من الركيزة قد تحدث.
5. فصل طبقة التحكم من العفن. تفعل ذلك ببطء ويجب الحرص على عدم تقشير نمط SU8. ثم قطع الجهاز حول محيطه والثقوب لكمة للوصول إلى قنوات السيطرة.
6. محاذاة تدفق وطبقات التحكم يدويا تحت المجسام. تبدأ من خلال التوفيق بين الزاوية العلوية اليسرى. صمام زر (طبقة التحكم) يجب أن يكون في منتصف غرفة التفاعل (طبقة تدفق). المقبل، محاذاة الصف الأول والصف الافراج بلطف طبقة سيطرة التوالي. تأكد من أن جميع الصمامات زر في منتصف دائرة من الدوائر الرجعية وأن صمامات الإدخال وعنوان عبور قنوات تدفق في الموضع الصحيح. ويمكن تكرار هذه العملية حتى يتم محاذاة محليا كافة الصفوف. في النهاية، إطلاق سراح أي توتر في PDMS بY رفع بعناية من الجانبين وزوايا. لا رفع أكثر من اللازم أو اختلال قد تحدث.
7. خبز لمدة 2 ساعة في 80 ° C.
8. قطع حول محيط الجهاز والجهاز قشر الطبقة الثانية (رقاقة) من العفن التدفق. لكمة ثقوب للوصول إلى قنوات تدفق (الشكل 1).

2. Arraying DNA والمواءمة جهاز

1. إنتاج الجينات الاصطناعية بواسطة PCR الجمعية. الجينات الاصطناعية ويؤلف من المروج T7، موقع ملزمة الريبوسوم (RBS)، ORF مع العلامات حاتمة اثنين (واحد في كل نهاية)، وT7 فاصل ^4. يمكن للجينات تختلف في الطول من 100 إلى بي بي، على الأقل، 5،000 سنة مضت.
2. إعداد الجينات الاصطناعية لarraying: إعداد خليط من الإيثيلين glycole بولي (1.25٪) وD-طرهالوز تبلور (125 ملغ / مل) والاستغناء 2 ميكرولتر في رد فعل في لوحة الآبار 384. وهذا الحل خفض ملزم لا رجعة فيه من الحمض النووي على الزجاج فضلا عن التصور خلال المواءمة ^10.
3. نقل الجينات الاصطناعية إلى لوحة الآبار 384. عادة يمكن تركيز الحمض النووي تتراوح من 10 نانوغرام / ميكرولتر إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر تركيز النهائي. إضافة DH ₂ O إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر (يعتمد على نوع وmicroarrayer PIN).
4. بقعة سلسلة من الجينات الاصطناعية على ركائز الزجاج المطلي الايبوكسي باستخدام microarrayer. نستخدم MicroGrid 610 (بيو الروبوتات) مع دبابيس سيليكون SMT-S75 (التجميعي بالتوازي مع ذلك، الولايات المتحدة الأمريكية). الاتصال الطباعة من الحمض النووي، مع هذه الدبابيس محددة، والنتائج في النقاط مع قطر من حوالي 100 ميكرون على سطح الزجاج. كل دبوس تحميل ما يكفي لحوالي 100 البقع. تأكد من ملاعب الأعمدة والصفوف تتوافق مع جهاز معين المستخدمة. الجهاز يحتوي على 16 نستخدمها أعمدة و 40 صفوف مع الملعب من 680 ميكرومتر في 320 ميكرون، على التوالي.
5. محاذاة يدويا الجهاز ميكروفلويديك إلى مجموعة الجينات تحت المجسام. ينبغي أن تكون بقعة DNA في وسط دائرة من الدوائر DNA. بدء المحاذاة عن طريق تحديد موقع الصف الأول من البقع بelow الصف الأول من الغرف DNA. ثم، يدخل في خط بقية الصفوف مع الانتهاء من ضبط للجهاز بأكمله. يجب مرة واحدة يتم محاذاة مجموعة الحرص على تخفيف التوتر في أي PDMS، من خلال رفع محليا. إذا كان هناك توتر في ترك PDMS أنه لا يجوز السندات بشكل جيد للميكروأري.
6. وأخيرا، السندات الجهاز إلى شريحة زجاجية عن طريق الحضانة بين عشية وضحاها على طبق ساخن في 80 ° C.

3. فتيلة وتفعيل جهاز

1. ودفعتها الصمامات في طبقة التحكم من جهاز الكمبيوتر باستخدام ابفيف. السيناريو ابفيف تسيطر على سلسلة من الملف اللولبي الصمامات الصغيرة عن طريق صندوق التحكم الإلكترونية (تم شراؤها من جامعة ستانفورد على microfluidics مسبك). توصيل متعددة صمام الملف اللولبي للهواء المضغوط، والتي تتحكم في تدفق الهواء والضغط في صمامات التحكم على الجهاز.
2. توصيل الجهاز إلى الملف اللولبي الصمامات المتعددة باستخدام أنابيب مرنة من البلاستيك مع القطر الداخلي قدرها 0.02 "(Tygon) والفولاذ المقاوم للصدأ دبوس (نيو إنجلاند الصغيرة أنابيب شركة).
3. ملء أنابيب مع أحواض دبي الجافة العالمية وإدراج دبوس في الثقوب وصول طبقة التحكم. تأكد من توصيل كل أنبوب لقناته السيطرة المقابلة.
4. تشغيل التطبيق على الكمبيوتر ابفيف لتفعيل قنوات السيطرة. من خلال تفعيل صمام من البرنامج النصي ابفيف، ونحن نطبق ضغط الهواء، والتي بدورها ستدفع المياه في القنوات تحكم PDMS. تعيين ضغط الهواء إلى 5 رطل لكل بوصة مربعة. فمن المستحسن لملء 'ساندويتش' وصمامات العنوان الأول، من أجل تحديد عبر قنوات المحادثات بين السيطرة على الأجهزة المعيبة. في حالة عبر المحادثات، سوف يشتغل من خط 'ساندويتش' تؤدي إلى السيطرة يشتغل من الرقبة أو خطوط تحكم زر. هذا هو مماثل لفترة قصيرة في الدائرة الكهربائية. جهاز التحدث مع الصليب معيب ولا يمكن استخدامها.
5. بعد كل القنوات وصمامات التحكم مليئة DDW، وتستعد للصمامات والجرميةدى لمنع تدفق قنوات تحتها. زيادة ضغط الهواء إلى 15 رطل لكل بوصة مربعة. يتم التحكم تفعيل صمام من برنامج ابفيف من خلال مجموعة من مفاتيح التشغيل / الإيقاف على الملف اللولبي الصمامات المتصلة الفردية. كل التبديل يسيطر على خط السيطرة محددة من خلال صمام الملف اللولبي في المقابلة. سوف تحول على زر التبديل (في البرنامج النصي) على ضغط الهواء في الأنبوب المقابلة. فإن ضغط الهواء في دفع DDW خط السيطرة وسيؤدي إلى توسيع الصمامات ميكروفلويديك، ومنع القناة في الأسفل. إيقاف صمام التحكم، وسوف الافراج عن الضغط الجوي واطلاق سراح في وقت لاحق حظر للقناة تدفق منها.
6. لضمان أن جميع الصمامات مفتوحة، قم بتوصيل أنبوب إلى واحدة من المدخلات وتدفق الهواء تدفق الجهاز على المبادرة 4-5. وهذا الإصدار أي صمامات زجة من شريحة زجاجية.
7. وأخيرا، وتستعد الجهاز وجاهزة. إغلاق كافة المدخلات و"الرقبة" الصمامات، لبدء الكيمياء السطح.

4. الكيمياء السطحية

1. من أجل تسهيل التجميع الذاتي للمجموعة والبروتين على سطح ومنع غير محددة الامتزاز داخل الجهاز ميكروفلويديك، يتم تعديل سطح كيميائيا:
2. لتدفق مكون من خلال الجهاز، قم بتوصيل أنبوب جديد مع الحل المطلوب لإحدى القنوات تدفق في الجهاز. الاتصال مجانا الجانب من الأنبوب إلى دليل متعددة وفتح تدفق ضغط الهواء (5 رطل لكل بوصة مربعة).
3. تحمل 40 ميكرولتر من BSA-المعقدة البيروكسيديز (1 ميكروغرام / ميكرولتر) في أنبوب جديد وتدفق ما يقرب من نصف ذلك لمدة 20 دقيقة من خلال الجهاز، فإن BSA ربط السطح الايبوكسي.
4. استخدام HEPES (50 ملم) لغسل الركيزة غير المتفاعل بين كل من الخطوات سطح الكيمياء المختلفة.
5. تدفق 25 Strepavidin ميكرولتر (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) لمدة 20 دقيقة على رأس BSA-المعقدة البيروكسيديز.
6. يغسل مع HEPES لمدة 5 دقائق.
7. إغلاق 'زر' صمام تدفق وبقية BSA-المعقدة البيروكسيديز (كما descriسرير أعلاه)، تخميل السطح المحيطة الزر.
8. يغسل مع HEPES لمدة 5 دقائق.
9. الإفراج عن 'زر' صمام تدفق و30 ميكرولتر من خماسي البيوتين، صاحب (0.16 ميكروغرام / ميكرولتر) لمدة 20 دقيقة. فإن الأجسام المضادة ربط strepavidin تتعرض، على وجه التحديد إلى المنطقة تحت 'زر' خلق مضاد له، علامة الصفيف.

5. البروتين التعبير

1. تعبر عن البروتينات الموجودة على الجهاز باستخدام الخلايا الشبكية الأرنب السريع والنسخ إلى جانب رد فعل الترجمة. التعبير البروتين من الجينات الاصطناعية رصدت على الجهاز بإنشاء مجموعة من البروتينات جاهزة للاستخدام. على سبيل المثال، واحد مثل هذا الاستخدام هو عن شاشة بروتين ملزمة.
2. فتح "الرقبة" الصمامات وتدفق الخلايا الشبكية الأرنب السريع والنسخ إلى جانب رد فعل الترجمة من خلال الجهاز إلى غرفة DNA. المقبل، أغلق "ساندويتش" الصمامات وفصل كل الجينات من بيئته. احتضان الجهاز على طبق ساخن لمدة 2.5 ساعة في 30 ° C. وأعرب العلاقات العامةسوف oteins نشر من غرفة DNA إلى رد فعل عفويا غرفة (صمام مفتوح الرقبة) وربط الأجسام المضادة ضد صاحب تحت صمام 'زر' شل حركة البروتين من خلال علامة C-نهايته.
3. تسمية البروتينات الأجسام المضادة مع Cy3 C-MYC. فإن الأجسام المضادة ربط حاتمة المناظرة التي تقع في البروتين N-محطة.
4. تحديد مستويات بروتين تعبير مع ماسح ضوئي ميكروأري (LS تحميل، TECAN) باستخدام الليزر 532 نانومتر و 575 نانومتر تصفية الانبعاثات.

6. ممثل النتائج

1. جهاز التصنيع

تم إنشاء تصميم رسومي للجهاز عن طريق أوتوكاد يعتمد على احتياجاتنا التجريبية. تمت طباعة التصميم على فيلم الشفافية من قبل اضع صورة ذات دقة عالية. هذه الشفافية بمثابة ألواح photomask في ضوئيه للإتصال به. تم استخدام تقنية متناهي الصغر لخلق سطح 3-D قوالب على رقاقة السيليكون التي تحددها أنماط المدرج في راعتاد الأقنعة.

كانت ملفقة الجهاز ميكروفلويديك على قالب سيليكون سيليكون صب المطاط الصناعي polydimethylsiloxane (PDMS، SYLGARD 184، داو كورنينج، الولايات المتحدة الأمريكية) (الشكل 1). كل جهاز يتكون من طبقتين PDMS الانحياز، وتدفق وطبقة التحكم. تعرض لأول مرة لبخار العفن (TMCS، الدريتش) chlorotrimethylsilane لمدة 10 دقيقة لتعزيز الافراج الاستومر بعد خطوات الخبز. وتم إعداد خليط من المطاط الصناعي السيليكون القائم وكيل علاج في اثنين من نسبة مختلفة 05:01 و 20:1 لمراقبة وقوالب تدفق على التوالي. وdegassed طبقة تحكم ويخبز لمدة 30 دقيقة في C. ° 80 وطبقة تدفق تدور في البداية المغلفة (Laurell، الولايات المتحدة الأمريكية) في 2600 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية ويخبز في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم فصل طبقة التحكم من قالب واللكم الثقوب والتحكم في الوصول القناة. المقبل، والانحياز للطبقات وتدفق التحكم يدويا تحت المجسام ويخبز لمدة 2 ساعة في 80 ° C. ومقشر الجهاز الطبقة الثانية وROM واللكم العفن والثقوب تدفق تدفق الوصول القنوات.

2. وصف الجهاز

يمكن للجهاز قدرة تتراوح بين 500 إلى الخلايا وحدة 10،000 (الشكل 2). الجهاز يتكون من طبقتين؛ طبقة تدفق (الرمادي) وسيطرة طبقة (لون). طبقة التحكم تحتوي على مجموعة متنوعة من الصمامات مع وظيفة مختلفة. وتتكون كل خلية وحدة، في طبقة التدفق، واحد واحد DNA غرفة التفاعل، ويتم التحكم من قبل ثلاثة أنواع من الصمامات الميكرو ميكانيكية؛ 'العنق'، 'زر'، و 'سندويتش "(الشكل 2A). تم حظر "الجينات الاصطناعية 'A رصدت المودعة داخل غرفة DNA من دائرة رد الفعل من قبل صمام' العنق '(الخضراء). يتم تنفيذ غسل محاصرة والميكانيكية من البروتينات السطحية المنضم في غرفة التفاعل من قبل صمام 'زر' (الأزرق). و'ساندويتش' صمام تمكن كل رد فعل لتحدث في خلية وحدة خاصة (الحمراء). يمكن تقسيم صمامات عنوان الجهاز يصل إلى 8 أقسام مستقلة، لاحNT حالة الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، وطبقة التحكم صمامات الإدخال التي تحتوي على تمكين تدفق السوائل المحددة في طبقة التدفق. القنوات تحكم PDMS الكامل مع أحواض دبي الجافة العالمية. عندما دفعتها صمام زيادة الضغط (15 رطل لكل بوصة مربعة) ينتج التوسع في PDMS. في الأماكن التي غشاء رقيق بما فيه الكفاية (أي عبور للرقابة وخطوط تدفق) هذا يكفي تماما لمنع خط التدفق. متوسط ​​ارتفاع الخلية وحدة هو 10 ميكرون، ومتوسط ​​حجم الخلية وحدة أقل من 1 NL.

3. البروتينات التعبير والكشف عن

وأعرب عن البروتينات الموجودة على الجهاز باستخدام الخلايا الشبكية الأرنب السريع والنسخ إلى جانب رد فعل الترجمة (Promega). إنشاء تعبير عن مجموعة من البروتينات البروتينات جاهزة للاستخدام في شاشة ملزم (الشكل 3). تم تحميل مزيج التعبير (12.5 ميكرولتر) في الجهاز ثم أغرقت في غرف DNA عن طريق فتح 'العنق' الصمامات. المقبل، وكانت 'ساندويتش' الصماماتأغلقت ترك وحضنت كل خلية من خلايا حدة فصل المجاورة لها والجهاز على لوحة الساخن لمدة 2.5 ساعة في 30 ° C. وأعرب البروتينات تنتشر عبر غرفة الجين في دائرة رد الفعل، حيث من محطة C-صاحب العلامة يمكن ربط الأجسام المضادة ضد صاحب (QIAGEN) مترجمة تحت صمام 'زر' شل حركة البروتين إلى السطح. وصفت البروتينات مع Cy3 C-MYC (سيغما)، والتي بد أن حاتمة المناظرة التي تقع في البروتين N-محطة وصفت ذلك. تم تحديد مستويات بروتين تعبير مع ماسح ضوئي ميكروأري (LS تحميل، TECAN) باستخدام ليزر 532 نانومتر و 575 نانومتر التصفية. مجموعة البروتين الناتج يتكون من مستويات مختلفة من التعبير البروتين. عادة، حوالي 20٪ من الجينات مكتبة تفشل في التعبير عن المستويات التي يمكن اكتشافها ل. لم يلاحظ أي ارتباط مع حجم البروتين ^3. تم تحديد مستويات الخلفية باستخدام الدوائر التي لم رصدت مع DNA. وهكذا، إشارات من غرف البروتين المقابلة هي إما بسبب نسور أو غير محددة الامتزاز من الأجسام المضادة وصفها.

الشكل 1. تصنيع الرقائق. (A) تم علاج قوالب مع الأبخرة TMCS لمدة 10 دقيقة. (B) ومحمل PDMS على السيطرة وقوالب السيليكون التدفق. (C) ويخبز كل السيطرة وقوالب تدفق في 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. (D) وطبقة التحكم مقشر من العفن، وخفض لحجم واللكم مداخل السيطرة. (E) ويتواءم طبقة إلى طبقة تحكم تدفق تحت المجسام وخبز ثم في 80 ° C لمدة 2 ساعة. بالتوازي مع تصنيع الجهاز PDMS، وmicroarrayed سلسلة من الجينات الاصطناعية على الزجاج الايبوكسي المغلفة ركائز (CEL شركاه). (F) ثم يتم محاذاة الجهاز إلى ميكروأري DNA محاصرة "الجينات الاصطناعية" داخل غرف DNA.

الشكل 2. صورة للجهاز PING. (A) الجهاز و consiش من طبقتين PDMS الانحياز (الرقابة وتدفق). طبقة تحتوي على تدفق موازية DNA ورد فعل الدوائر (الرمادي) التي تسيطر عليها الصمامات الميكرو ميكانيكية ("زر"، "ساندويتش" و "الرقبة") في طبقة التحكم. (B) يتم محاذاة الطبقات إلى ميكروأري المطبوعة، التي برامج كل غرفة DNA مع بقعة واحدة. هذا يزيل أي تلوث محتمل.

الشكل 3. وأعرب عن صور الفلورسنت من مجموعة البروتين أنشاء مع شريحة ميكروفلويديك. والجينات بقعة المطبوعة إلى البروتينات داخل الجهاز (في قاعة DNA) وتم سحب وصولا الى السطح (تحت صمام "زر" في غرفة التفاعل) من خلال بهم C-محطة صاحب العلامة. تم الكشف عن بروتين تعبير باستخدام C-بهم MYC N-محطة علامة والأجسام المضادة المحددة الفلورسنت. شدة إشارة مختلفة تشير إلى مختلف مستويات التعبير البروتين. خدم الامم المتحدة رصدت الدوائر وضوابط لخلفية جنيهvels.

Discussion

في هذه الورقة نقدم طريقة لتوليد البروتين صفائف في الإنتاجية العالية باستخدام منصة ميكروفلويديك. ويستند الجيل مجموعة على الطباعة من القوالب ميكروأري DNA والبروتين في التعبير عن DNA داخل جهاز ميكروفلويديك.

برنامجنا ميكروفلويد?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
كاشف / معدات	شركة	كتالوج رقم
PDMS-184 SYLGARD	داو كورنينج USA	ESSEX-DC
Chlorotrimethylsilane (TMCS	سيغما الدريخ	C72854
ركائز الزجاج المطلي الايبوكسي	CEL المنتسبين USA	VEPO-25C
البولي إثيلين glycole (PEG)	سيغما الدريخ	81260
D-طرهالوز تبلور	سيغما الدريخ	T9531
المعقدة البيروكسيديز-BSA	خرق	PIR-29130
Neutravidin	خرق	31050
خماسي صاحب-البيوتين	QIAGEN	34440
HEPES	صناعات البيولوجية	03-025-1B
TNT-T7	Promega	L5540
C-MYC Cy3 الأجسام المضادة	سيغما الدريخ
تحكم مربع	ستانفورد على microfluidics مسبك
قالب	ستانفورد على microfluidics مسبك
دبوس	نيو انغلاند الصغيرة أنابيب شركة
Tygon microbore أنابيب	Tygon	S-54-HL
Microarrayer	الروبوتات الحيوية	MicroGrid 610
سيليكون دبابيس	بالتوازي SYNأطروحة	SMT-S75