Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Özet

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Özet

Bu tür sistemler biyoloji gibi hızla artan alanları, büyük sistemlerde yüksek verimli ve yüksek kalitede ölçüm sağlayan yeni teknolojilerin geliştirilmesi ve uygulanması gerekmektedir. Mikroakiskan, biyokimyasal biyofiziksel ve hücre tabanlı deneyleri ¹ kapsayan, bu tür on-chip yüksek çıktılı tarama deneyleri gerçekleştirmek gibi, bu gereksinimleri birçok yerine getirmek için vaat ediyor. Mikroakışkanları cihazların ilk günlerinden bu yana, bu alanda büyük ölçüde mikroakışkan büyük ölçekli entegrasyon ^2,3 gelişimine öncülük etmek, gelişti. Bu teknoloji, bir pul büyüklüğünde yer kaplayan (Şekil 1) ile tek bir cihazda mikromekanik vanaları binlerce entegrasyon sağlar. Biz PING (Protein Etkileşim Ağı Generator) adlı proteini diziler (Şekil 2) in vitro ifade oluşturmak için bir high-throughput mikroakışkan platformu geliştirdi. Bu diziler birçok deneyler için bir şablon görevi görebilirgibi protein-protein ^{4, protein-5} RNA ya da protein-DNA ⁶ etkileşimleri.

Cihaz tek bir microarrayer kullanılarak programlanır reaksiyon odaları binlerce oluşur. Standart mikroarray lekelenme teknikleri kullanarak mikroarrayler üreten Ayrıca potansiyel kontaminasyon veya çapraz reaktivite ortadan kaldırarak, tek bir nokta ile ve arayüz aygıtları programlar için bu baskılı microarrays her odası hizalama, proteinler ^7, DNA ^8, küçük moleküllerin arraying için izin de çok modüler ve hatta kolloidal süspansiyonlar. Biyolojik bilimler üzerine mikroakışkanları arasında potansiyel etkisi önemlidir. Mikroakışkanları dayalı testler bir dizi zaten biyolojik sistemlerin yapısı ve fonksiyonu yeni bakış açıları sağlamıştır ve mikroakışkanları alanında biyoloji etkilemeye devam edecek.

Protokol

1. Cihaz İmalatı

1. Stanford Mikroakiskan Döküm (den DTPA-D SU-8 kontrol kalıp ve SPR220-7 akış kalıp Satın www.stanford.edu / grup / döküm ).
2. Pişirme adımları sonra ⁹ elastomer salınımını teşvik etmek 10 dakika chlorotrimethylsilane (TMCS) buharı silikon kalıplar Açığa.
3. İki farklı oranlar sırasıyla 5:1 vermekte kontrolü ve akış kalıpları için 20:1, silikon bazlı elastomer ve sertleştirici (iyice karıştırın) karışımı hazırlayın. Farklı oranlarda çoklu katmanlar için uygun bağların gereklidir.
4. Kontrol tabakası (yaklaşık 5 mm yükseklik) 05:01 PDMS dökün. 80 kontrol tabakası ve 30 dakika için fırına Degas ° C. Sonra, Sıkma kat (Laurell, USA) 60 saniye için 2.600 rpm'de akış tabaka üzerinde 20:01 PDMS ve karışım 30 dakika için 80 ° C 'de fırında. Spin lak hızı bir basınçta valf harekete için optimize edilmiştir15 psi. Daha hızlı dönen bir alt basınç aktivasyonu ve bunun tersi olan bir ince tabaka ile sonuçlanacaktır. Kullandığımız cihazlar substrattan dekolmanı meydana gelebilecek Yukarıda, akış kontrolü 25 psi ve 10 psi bir sınırı vardır.
5. Kalıptan kontrol tabakası ayırın. Yavaş yavaş ve değil SU8 desen soyma dikkat etmeyin. Sonra kontrol kanalları erişmek için kendi çevre ve zımba delikleri çevresinde cihaz kesti.
6. Elle stereoskop altında akış ve kontrol tabakaları hizalayın. Sol üst köşesine hizalayarak başlayın; düğmesine vana (kontrol tabakası) reaksiyon odası (akış tabakası) ortasında olmalıdır. Ardından, ilk satır hizalayın ve yavaşça satır tarafından kontrol katmanı satır bırakın. Her düğme valfleri reaksiyon odaları ortasında ve adres ve giriş vanaları doğru konumda akış kanalları çapraz ki olduğundan emin olun. Tüm satırlar hizalanır kadar işlem lokal tekrar edilebilir. Sonunda, PDMS b herhangi bir gerilim serbesty kenar ve köşeler dikkatlice kaldırarak. Çok fazla kaldırmayın veya kayma meydana gelebilir.
7. 80 de 2 saat için fırına ° C.
8. Cihazın dış kenarı boyunca ve akım kalıp iki tabaka cihaz (çip) soyma kesin. Akış kanalları (Şekil 1) erişmek için delikler.

2. DNA Arraying ve Aygıt Yerleşimi

1. Montaj PCR ile sentetik gen üretin. Sentetik genler T7 promotor, ribozom bağlanma yeri (RBS), iki epitop etiketleri ile ORF (her iki ucunda) ve T7 terminatör ⁴ beste vardır. Genleri, en azından, en fazla 100 bp uzunluğunda 5000 bp değişebilir.
2. Arraying için sentetik genler hazırlayın: poli etilen glikol (% 1.25) ve D-trehaloz dihidrat (125 mg / ml) bir karışımı hazırlandı ve 384 kuyu plakası reaksiyon başına 2 ul dağıtın. Bu çözelti hizalama ¹⁰ boyunca görselleştirme için hem de cam DNA tersinmez bağlayıcı azaltacaktır.
3. 384 kuyu plaka sentetik gen aktarın. Genellikle DNA konsantrasyonları 10 ul / ng 100 ng / ul nihai konsantrasyonu değişir. 20 ul (microarrayer ve pin tipi bağlıdır) bir son hacim dH ₂ O ekleyin.
4. Bir microarrayer kullanılarak epoksi kaplı cam tabanlar üzerinde sentetik bir seri gen Nokta. Biz SMT-S75 silikon işaretçilerine (Paralel Sentez, ABD) ile MicroGrid 610 (Bio Robotik) kullanın. Bu özel pimleri ile, DNA baskı İletişim, cam yüzey üzerinde yaklaşık 100 um çaplı noktalar ile sonuçlanır. Her pim yükü yaklaşık 100 lekeler için yeterlidir. Sütun ve satır sahalar kullanılan belirli bir cihaza uygun olduğundan emin olun. Kullandığımız cihaz 16 sütun ve sırasıyla 320 mikron ile 680 mikron arasında bir adım ile 40 satır içerir.
5. Elle stereoskop altında gen dizisine mikroakışkan cihaz hizalayın. DNA nokta DNA odaları ortasında olmalıdır. Noktalar b ilk satırı bularak uyum başlayınDNA odalarının ilk satırı elow. Ardından, satır kalanı tüm cihaz ince ayar ile bitiş çizgisine getirmek. Dizi hizalanmış sonra bakım yerel kaldırarak, PDMS herhangi stresi hafifletmek için alınmalıdır. Bu mikroarray iyi bağ olmayabilir PDMS kalan gerginlik varsa.
6. Nihayet, 80 bir sıcak plaka üzerinde gecelik inkübasyon tarafından cam slayt bağ cihaz ° C.

3. Hazırlama ve Cihaz etkinleştirme

1. Kontrol tabakası olarak valf LabVIEW kullanarak bilgisayar kumanda edilir. LabVIEW komut dosyası bir elektronik kontrol kutusu (Stanford Mikroakiskan Döküm satın) ile selenoid mikro vana bir dizi kontrol eder. Solenoid valf manifoldu cihaz üzerinde kontrol valfleri içine hava akımı ve basıncı kontrol basınçlı hava, bağlanır.
2. (Tygon "0.02 iç çapı ile esnek plastik boru kullanarak solenoid valfler manifolduna bağlayın) Ve paslanmaz çelik pim (New England Küçük Tüpler Corporation).
3. DDW ile tüpler doldurun ve kontrol katmanı erişim deliklere pimi takın. Her bir tüp karşılık gelen kumanda kanalına bağlı olduğundan emin olun.
4. Kontrol kanalları etkinleştirmek için bilgisayarda LabVIEW uygulamasını çalıştırın. LabVIEW script valfi devreye sokarak, biz sırayla PDMS kontrol kanalları içine su itecektir hava basıncı, uygulayın. Hava basıncı 5 psi ayarlayın. Bu arızalı cihazların kontrol kanalları arasındaki çapraz-görüşmeler tespit etmek için, ilk olarak "sandviç" ve adres valfleri doldurmak için tavsiye edilir. Çapraz görüşmeler durumunda, 'sandviç' kontrol çizgisinin harekete boyun veya düğme kontrol hatları birinin harekete yol açacaktır. Bu, bir elektrik devresi içinde bir kısa benzer. Diyafoniyi olan bir cihaz arızalı ve kullanılamaz.
5. Tüm kontrol kanalları ve vanalar DDW dolu sonra, vanalar astarlanmış ve rea vardırAltlarında akış kanalları engellemek için dy. Hava basıncı 15 psi artırın. Valf Etkinleştirme bireysel selenoid vana bağlı kapalı / anahtarları bir dizi aracılığıyla LabVIEW programı tarafından kontrol edilir. Her anahtar karşılık gelen selenoid vana aracılığıyla belirli bir kontrol hattı kontrol eder. Düğmesi (komut) Açma gelen tüp hava basıncı uygulanır. Hava basıncı kontrol hattı içinde DDW itmek ve alt kanal bloke edici, mikroakışkan valf genişlemesi ile sonuçlanır. Bir kontrol vanası kapatılması, hava basıncı serbest bırakmak ve daha sonra ilgili akış kanal engelleme yayınlayacak.
6. Tüm valf açık olduğundan emin olmak için, akım girişleri ve 4-5 psi cihaz içine hava akış birine göre bir tüp bağlanır. Bu cam slayt herhangi bir yapışkan vanalar yayınlayacak.
7. Son olarak, cihaz, astar ve hazır edilir. Yüzey kimyası başlatmak için tüm giriş ve 'boyun' valfleri kapatın.

4. Yüzey Kimyası

1. Yüzey üzerinde bir protein dizinin kendi montaj kolaylaştırmak ve mikroakışkan cihaz içinde spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için, yüzeyin kimyasal olarak modifiye edilir:
2. Aygıt aracılığıyla bir bileşen akıtmak için, cihaz içinde akış kanallarından biri için gerekli çözelti ile yeni bir tüp bağlanır. Kılavuz manifolduna tüpün serbest yan bağlayın ve hava basıncı akımı (5 psi) açın.
3. Cihazından 20 dk için yaklaşık yarım yeni bir tüp içinde ve akış biyotinile-BSA (1 ug / ul), 40 ul yerleştirin BSA epoksi yüzeyine bağlanır.
4. Farklı yüzey kimyası adımların her biri arasında reaksiyona girmeyen yüzey yıkama için HEPES (50 mM) kullanın.
5. Biyotinile-BSA üzerine, 20 dakika boyunca 25 ul akış Strepavidin (0.5 ug / ul).
6. 5 dk Hepes ile yıkayın.
7. 'Butonu' vanasını kapatın ve biyotin-BSA kalanı (anlatıldığı şekilde akardüğme çevreleyen yüzey pasifleştirici yukarıda yatak).
8. 5 dk Hepes ile yıkayın.
9. 20 dakika penta-His-biotin 'düğme' vana ve akış 30 ul (0.16 mikrogram / ul) bırakın. Antikor maruz strepavidin bağlanacaktır; özel bir anti His-etiketi dizi oluşturma 'düğme' altındaki alana.

5. Protein Ekspresyonu

1. Tavşan retikülosit hızlı birleştiğinde transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu kullanılarak cihaz üzerinde proteinlerin ifade eder. Cihaz üzerinde benekli sentetik genlerden protein ekspresyonu kullanıma hazır proteinler bir dizi oluşturur. Örneğin, böyle bir kullanımı bir protein bağlama ekran içindir.
2. 'Boyun' valfleri ve akış tavşan retikülosit pratik birleştiğinde transkripsiyon ve DNA odasına cihaz aracılığıyla çeviri reaksiyonu açın. Sonra, 'sandviç' vanalarını kapatın ve çevresinin her gen ayırın. 30. az 2.5 saat için bir sıcak levha üzerinde inkübe cihaz ° C. Ifade proteins, C-terminali etiket aracılığıyla protein hareketsizleştirici "butonunu" kapağın altında anti-His antikor için DNA odasından gelen reaksiyon oda kendiliğinden (boyun valf açıktır) ve bağlama için dağılacaktır.
3. C-myc antikoru ile Cy3 proteinleri etiketleyin. Antikor proteini N-ucu bulunan karşılık gelen bir epitopa bağlanır.
4. Bir 532 nm lazer ve 575 nm emisyon filtresi kullanarak bir mikroarray tarayıcı (LS Reloaded, Tecan) ile protein ekspresyon düzeyleri belirleyin.

6. Temsilcisi Sonuçlar

1. Cihaz İmalatı

Cihaz için bir grafik tasarım bizim deneysel gereksinimlerine dayalı AutoCAD tarafından oluşturuldu. Tasarım, yüksek çözünürlüklü görüntü ayarlayıcı bir asetata basılmış. Bu şeffaflık temas fotolitografi bir Fotoşablonlarda olarak hizmet vermektedir. Bir yüzey mikroişleme tekniği t üzerinde yazılı desenleri tarafından belirlenen bir silikon yonga üzerine 3-D şablonları oluşturmak için kullanılanO maske kullanılmalıdır.

Mikroakışkan cihaz silikon elastomer polidimetilsiloksan (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, ABD) (Şekil 1) döküm silikon kalıp üzerinde imal edilmiştir. Her cihaz, iki hizalanmış PDMS katmanları, ve akış kontrol tabakasını içermektedir. Kalıp ilk pişirme adımlardan sonra elastomer salınımını teşvik etmek 10 dakika chlorotrimethylsilane (TMCS, Aldrich) buhar maruz kalmıştır. Silikon bazlı elastomer ve sertleştirici bir karışım, iki farklı oranı ise 5:01 ve kontrol ve akış kalıpları için 20:1 içinde hazırlanmıştır. Kontrol tabakası 80 ° C'de gazdan arındırıldı ve 30 dakika süre ile pişmiş Akış tabakası başlangıçta 60 saniye 2,600 rpm'de (Laurell, ABD) kaplamalı spin ° C 30 dakika 80 pişmiş. Kontrol katmanı kendi kalıp ayrıldı ve kontrol kanal erişimi delikler vardı. Daha sonra, akış kontrol tabakaları ve bir stereoskop altında el ile hizalanır ve 80 de 2 saat boyunca pişirilmiştir ° C. İki katman cihazın f soyuldurom akışı kalıp ve akış kanallarına erişim delikler vardı.

2. Aygıt Tanımı

Cihaz kapasitesi 500 ila 10,000 birim hücreler (Şekil 2) olabilir. Cihaz iki katmandan oluşur; akım tabakası (gri) ve kontrol katmanı (renk). Kontrol katmanı farklı fonksiyonu ile vanalar çeşitli içerir. Akış tabaka içinde her bir birim hücre, bir DNA ve bir reaksiyon odasına oluşur ve mikro vana üç tipleri tarafından kontrol edilir; "boyun", "düğme", ve "sandviç" (Şekil 2A). DNA odasının içindeki yatırılan bir benekli 'sentetik gen' 'Boyun' vana (yeşil) ile reaksiyon odası engellenir. Reaksiyon oda yüzey bağlı proteinler sıkışması ve mekanik yıkama "butonunu" kapağın (mavi) tarafından gerçekleştirilir. "Sandviç" valf kendi başına birim hücre (kırmızı) meydana geldiği her bir tepki verir. Adresi vanalar differe için, 8 bağımsız bölüm için Aygıtı bölebilirsiniznt durumu tahlil. Buna ek olarak, kontrol tabakası akış tabakası içine seçilmiş akışkan akışını sağlamak giriş valf içerir. PDMS kontrol kanalları DDW ile dolu. PDMS genişleme bir valf basınç artışı devreye girer (15 psi) sonuçları. Membran yeterince ince olduğu yerlerde (örneğin, kontrol ve akış hatlarının kapısı) bu tamamen akış hattı engellemek için yeterlidir. Ortalama birim hücre yüksekliği 10 mikron ve ortalama birim hücre hacmi az 1 nl olduğunu.

3. Proteinler İfade ve Algılama

Proteinler tavşan retikülosit pratik birleştiğinde transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu (Promega) kullanarak cihaz üzerinde ifade edildi. Proteinlerin ekspresyonu, bir bağlayıcı ekran içinde kullanım için hazır protein (Şekil 3) arasında bir dizi oluşturulur. Bir ifade karışımı (12.5 ul) cihazın içine yüklenen ve daha sonra 'Boyun' valfleri açarak DNA odalarına akınına uğradı. Sonra, 'sandviç' vanalar vardıkomşu hücreler ve cihazı ayrılmış her bir birim hücrenin 30 2.5 saat için bir sıcak levha üzerinde inkübe edildi bırakarak ° C'de kapatılmış Kendi C-terminali His etiketi anti-His antikoru (Qiagen) yüzeyine protein hareketsizleştirici 'düğme' valf altında yer bağlamak olabilir reaksiyon odasına, içine bölme gen tarafından yayılır proteinler. Proteinler protein N-ucu bulunan karşılık gelen bir epitopa bağlanır ve bir etiketli c-myc Cy3 (Sigma) ile işaretlendi. Protein ekspresyon düzeyleri bir 532 nm lazer ve 575 nm filtresini kullanarak bir mikroarray tarayıcı (LS Reloaded, Tecan) ile belirlenmiştir. Elde edilen protein dizisinin proteini ekspresyonu, değişen oluşur. Genellikle, bir gen kütüphanesi yaklaşık% 20, tespit edilebilir seviyelerde ifade etmek başarısız olmaktadır. Protein boyutu ile korelasyon ³ gözlenmiştir. Arka plan seviyeleri DNA ile tespit edilmemiştir odası kullanılarak belirlenmiştir. Böylece, ilgili protein odalarından sinyalleri n ya nedeniyleoise ya da etiketleme antikorların spesifik olmayan adsorpsiyon.

Şekil 1. Chip Fabrikasyon. (A) kalıplar 10 dakika TMCS buharlar ile tedavi edildi. (B) PDMS kontrolü ve akış silikon kalıplar üzerine dökülmektedir. (C) her ikisi de kontrol ve akış kalıplar 80 ° C'de 30 dakika boyunca pişirilir. (D) kalıp soyulmuş kontrol katmanı, ebatlarına göre kesilmiş ve kontrol girişlerine açılmıştır. (E) kontrol tabakası bir stereoskop altında akış tabaka ile hizalanır ve daha sonra 80 pişirilir 2 saat ° C. PDMS aygıt yapılmasına paralel olarak, sentetik bir seri gen epoksi kaplı cam yüzeyler (CEL Associates) üzerine microarrayed edilir. (F) aygıtı sonra DNA odaları içinde 'Sentetik genler' yakalama DNA mikroarray hizalanır.

Şekil 2. PING Cihaz bir Fotoğraf. (A) Cihaz consiiki bağlantısız PDMS katmanları (kontrol ve akış) st. Akış katman kontrol tabakası olarak mikromekanik valfler ("ayarlamak", "sandviç" ve "boyun") tarafından kontrol edilen paralel DNA ve reaksiyon odaları (gri) içerir. (B) katmanları basılı mikroarray, tek bir nokta ile her DNA odasına programlarına hizalanır. Bu herhangi bir potansiyel kontaminasyonu ortadan kaldırır.

Şekil 3,. Bir Mikroakışkan Chip ile düzenlendi Bir ​​Protein Array Floresan Görüntüleri. Yazdırılan spot genler cihazın içindeki proteinler (DNA odasında) dile getirilmiştir ve onların aracılığıyla (reaksiyon odasında "düğmesi" kapak altında) yüzeye yıktırılmıştır C-terminali Onun etiketi. Protein ifade onların c-myc N-terminali, etiket ve belirli bir floresan antikor kullanılarak tespit edildi. Farklı sinyal şiddetleri farklı protein ekspresyon düzeyleri göstermektedir. Un-benekli odaları arka le için kontrol grubu olarakVELS.

Tartışmalar

Bu yazıda, bir mikroakışkan platformu kullanarak yüksek throughput nesil protein dizileri için bir yöntem mevcut. Dizi nesil DNA şablonları mikroarray baskı ve mikroakışkan cihaz içinde DNA'nın in vitro protein ekspresyonu dayanır.

Bizim roman mikroakışkan platform proteomik için umut verici ve genel bir araç haline anda kullanılan yöntemler üzerinde birçok önemli avantajlara sahiptir. Bir avantaj zar-bağlı proteinler ile. Mikrozomal membran

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Ekipman	Şirket	Katalog numarası
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning USA	ESSEX-DC
Chlorotrimethylsilane (TMCS	Sigma-Aldrich	C72854
Epoksi kaplı cam yüzeyler	CEL Associates ABD	VEPO-25C
Poli etilen glikol (PEG)	Sigma-Aldrich	81260
D-trehaloz dihidrat	Sigma-Aldrich	T9531
Biotinlenmiş-BSA	Delmek	PIR-29130
Neutravidin	Delmek	31050
Penta-His-biotin	Qiagen	34440
Hepes	Biyolojik Sanayi	03-025-1B
TNT-T7	Promega	L5540
C-myc Cy3 antikor	Sigma-Aldrich
Kontrol kutusu	Stanford Mikroakiskan Döküm
Kalıp	Stanford Mikroakiskan Döküm
Pin	New England Küçük Tüpler Corporation'ın
Tygon microbore boru	Tygon	S-54-HL
Microarrayer	Bio Robotik	MicroGrid 610
Silikon işaretçilerine	Paralel Syntez	SMT-S75