마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

요약

우리는 단백질 배열의 표현을위한 마이크로 유체 접근 방식을 제시한다. 이 장치는 마이크로 기계 밸브에 의해 제어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 마이크로 유체 장치는 microarray 인쇄 유전자 도서관에 결합되어 있습니다. 이러한 유전자 그런 다음 베꼈 및 실험 사용할 준비가 단백질 배열의 결과로, 칩에 번역되어 있습니다.

초록

이러한 시스템 생물학 등 급속도로 증가 분야는 대규모 시스템의 높은 처리량 및 고 충실도 측정을 가능하게하는 새로운 기술의 개발과 구현을 필요로합니다. Microfluidics는 생화학 biophysical 및 셀 기반 assays에게 ¹ 포괄 같은 칩에 높은 처리량 검사 실험을 수행으로 이러한 요구 사항의 많은 부분을 수행하기 위해 약속드립니다. microfluidics 장치의 초기부터,이 필드는 크게 마이크로 대규모 통합 ^2,3의 개발로 이어지는, 발전하고 있습니다. 이 기술은 우표 크기의 풋 프린트 (그림 1) 단일 장치에 micromechanical 밸브의 수천의 통합 할 수 있습니다. 우리는 PING (단백질 상호 작용 네트워크 생성기)이라는 단백질 어레이 (그림 2)의 체외 식에 생성하기위한 높은 처리량 마이크로 유체 플랫폼을 개발했습니다. 이러한 배열은 많은 실험을위한 템플릿으로 제공 할 수같은 단백질 단백질 ^4, 단백질 RNA ⁵ 단백질 DNA 상호 작용 ^6.

이 장치는 개별적으로 microarrayer를 사용하여 프로그램되어 반응 챔버의 수천으로 구성되어 있습니다. 표준 microarray 야생 기술을 사용하여 microarrays를 생성, 또한 잠재적 인 오염 또는 교차 반응성을 제거 하나의 장소로 microfluidics 장치 프로그램에 이러한 인쇄 microarrays의 각 방을 정렬하면, 단백질 ^7, DNA ^8, 작은 분자의 arraying을 허용하는, 매우 모듈입니다 심지어 콜로이드 현탁액. 생물 과학에 microfluidics의 잠재적 인 영향은 중요하다. microfluidics 기반 assays의 수는 이미 생물학적 시스템의 구조와 기능에 새로운 통찰력을 제공하고, microfluidics 분야는 생물에 영향을 할 것입니다.

프로토콜

1. 장치 제작

1. 스탠포드 Microfluidics 주조 (에서 DTPA-D SU-8 제어 금형 및 SPR220-7 흐름 금형 구입 www.stanford.edu / 그룹 / 주물을 ).
2. 베이킹 단계 ^9시 엘라스토머 자료를 홍보하기 위해 10 분 동안 chlorotrimethylsilane (TMCS) 증기로 실리콘 금형을 쉽게받을 수 있습니다.
3. 두 개의 서로 다른 비율 각각 5시 1분과 제어 및 흐름 금형에 대한 20시 1분에 실리콘 기반의 탄성 중합체 및 경화 에이전트 (잘 혼합)의 혼합물을 준비한다. 다른 비율은 여러 층의 적절한 결합을 위해 필요합니다.
4. 제어 계층 (약 5mm의 높이)에 5시 1분 PDMS를 부어. 80에서 제어 레이어와 30 분 동안 빵을 구워 가스를 제거하다 ° C. 그런 다음 스핀 코트 (Laurell, USA) 60 초 동안 2,600 rpm으로 흐름 층에있는 20시 1분 PDMS 혼합하고 30 분에 80 ° C에서 빵을 구워. 스핀 coater 속도는 압력 밸브 작동에 최적화되어 있습니다15 psi의. 빠른 회전은 낮은 활성화 압력과 반대의와 얇은 층에 발생합니다. 우리가 사용하는 장치는 기판에서 분리가 발생할 수있는 위의 흐름에 제어 25 PSI 10 psi의 제한이 있습니다.
5. 금형에서 제어 레이어를 분리합니다. 그것은 천천히하지 않도록 SU8 패턴 껍질을 조심하게. 그런 다음 제어 채널에 액세스하기 위해 주변과 펀치 구멍 주변 장치를 끄도록.
6. 수동으로 입체경 아래의 흐름과 제어 레이어를 맞 춥니 다. 왼쪽 상단 모서리를 정렬하여 시작하고, 버튼 밸브 (제어 계층)는 반응 챔버 (흐름 층)의 중간에 있어야합니다. 다음, 첫 번째 행을 정렬하고 부드럽게 행에 의해 제어 계층 행을 놓습니다. 모든 버튼 밸브는 반응 챔버의 중앙에 있으며, 주소와 입력 밸브가 올바른 위치에서 유동 채널을 넘어 있는지 확인하십시오. 모든 행이 정렬 될 때까지 프로세스는 로컬 반복 할 수 있습니다. 말에 PDMS B의 모든 긴장을 풀어y는 측면과 모서리에서 조심스럽게 들어 올렸다. 너무 많이 들지 마십시오 또는 misalignment가 발생할 수 있습니다.
7. 80 2 시간을 위해 굽 ° C.
8. 장치의 주위에과 유동 몰드에서 두 개의 계층 장치 (칩) 껍질을 잘라. 흐름 채널을 (그림 1)에 액세스 할 구멍을 펀치.

2. DNA의 Arraying 및 장치 정렬

1. 조립 PCR에 의해 합성 유전자를 생산하고 있습니다. 합성 유전자는 T7 프로모터, ribosome 구속력이 사이트 (RBS), 두 에피토프 태그와 ORF (각 끝 부분에 하나), 그리고 T7 종결 ⁴ 구성되어 있습니다. 유전자는 적어도 최대 100 BP의 길이 5,000 BP를 다를 수 있습니다.
2. arraying의 합성 유전자를 준비 : 폴리 에틸렌 glycole (1.25 %) 및 ​​D-trehalose 이수화 (125 MG / ML)의 혼합물을 준비하고 384 우물 판에 반응 당 2 μl을 투여. 이 솔루션은 정렬 ^10시 시각화를 위해뿐만 아니라 유리에 DNA의 돌이킬 수없는 바인딩을 줄일 수 있습니다.
3. 384 우물 판에 합성 유전자를 전송합니다. 보통 DNA 농도는 10 ~ μl / NG 100 NG / μl 최종 농도 범위 수 있습니다. 20 μl (microarrayer 및 핀 종류에 따라 다름)의 최종 볼륨에 DH ₂ O를 추가합니다.
4. microarrayer를 사용하여 에폭시 코팅 유리 기판 위에 합성 유전자의 시리즈를 정확 해요. 우리는 SMT-S75 실​​리콘 핀 (병렬 합성, USA)와 MicroGrid 610 (바이오 로보틱스)을 사용합니다. 이러한 특정 핀으로, DNA의 인쇄에 문의 유리 표면에 약 100 μm의 직경이 곳에서 발생합니다. 각 핀로드는 약 100 곳에 충분하다. 열 및 행 경기장에 사용 된 특정 장치에 해당해야합니다. 우리가 사용하는 장치는 16 열 각각 320 μm에 의해 680 μm의 피치 40 행이 포함되어 있습니다.
5. 수동으로 입체경에서 유전자 배열에 마이크로 유체 장치를 맞 춥니 다. DNA 명소는 DNA 챔버의 중앙에 있어야합니다. 장소 B의 첫 번째 행을 찾아 정렬을 시작합니다DNA 챔버의 첫 번째 행을 elow. 그런 다음 행의 나머지는 전체 장치의 미세 조정을 마무리 라인에 가져. 배열이 정렬되면 치료가 로컬을 올려서, PDMS에 모든 스트레스를 완화하기 위해주의해야한다. 는 microarray에 잘 결합 할 수 없습니다 PDMS에 남아 긴장이있는 경우.
6. 마지막으로, 80에서 핫 플레이트에서 하룻밤 배양하여 유리 슬라이드에 결합 장치를 ° C.

3. 프라이밍 및 장치를 활성화

1. 제어 계층의 밸브는 LabVIEW를 사용하여 컴퓨터에서 구동됩니다. LabVIEW 스크립트는 전자 제어 상자 (스탠포드 Microfluidics 주조에서 구입)를 통해 솔레노이드 밸브 마이크로 일련의를 제어합니다. 솔레노이드 밸브 매니 폴드는 장치의 제어 밸브에 공기 흐름과 압력을 제어 압축 공기에 연결되어 있습니다.
2. (Tygon "0.02의 내부 직경 유연한 플라스틱 튜브를 사용하여 솔레노이드 밸브 매니 폴드에 장치를 연결)과 스테인레스 스틸 핀 (뉴 잉글랜드 작은 튜브 주식회사).
3. DDW로 튜브를 기입하여 제어 계층의 액세스 구멍에 핀을 삽입합니다. 각 튜브는 해당 제어 채널에 연결되어 있는지 확인합니다.
4. 제어 채널을 활성화하기 위해 컴퓨터에 LabVIEW 응용 프로그램을 실행합니다. LabVIEW 스크립트에서 밸브를 활성화함으로써, 우리는 결과적으로 PDMS 제어 채널로 물을 밀어 것입니다 공기 압력을 적용 할 수 있습니다. 공기 압력 5 PSI으로 설정합니다. 그것은 결함이있는 장치의 제어 채널 사이의 교차 대화를 식별하기 위해 먼저 '샌드위치'와 주소 밸브를 작성하는 것이 좋습니다. 간 회담 경우에는 '샌드위치'제어 라인의 작동은 목이나 버튼 제어 라인 중 하나의 작동으로 이어질 것입니다. 이 전기 회로의 짧은 비슷합니다. 크로스 토크와 장치에 결함이 있으며 사용할 수 없습니다.
5. 모든 제어 채널과 밸브 DDW 가득 후, 밸브는 중이오 정말이에요 아르그 아래에있는 흐름 채널을 차단하는 다이. 공기 압력 15 PSI로 늘립니다. 밸브 활성화는 개별 솔레노이드 밸브에 연결에 온 / 오프 스위치의 집합을 통해 LabVIEW 프로그램에서 제어됩니다. 각 스위치는 해당 솔레노이드 밸브를 통해 특정 제어 라인을 제어합니다. 스위치 버튼 (스크립트)를 사용하면 해당 관에 공기 압력을 적용합니다. 공기 압력은 제어 라인에 DDW 밀어되며, 아래의 채널을 차단, 마이크로 유체 밸브 확장 될 것입니다. 제어 밸브를 사용하지 않도록 설정하면, 공기 압력을 출시하고 이후 각각의 흐름 채널의 차단을 해제합니다.
6. 모든 밸브가 열려 있는지 확인하기 위해, 유동 입력 및 4-5 PSI에서 장치로 유동 공기 중 하나에 튜브를 연결합니다. 이 유리 슬라이드로부터 끈적 밸브를 출시 할 예정이다.
7. 마지막으로, 장치가 준비되어 대기 중이오. 표면 화학을 시작하기위한 모든 입력과 '목'밸브를 닫습니다.

4. 표면 화학

1. 표면에 단백질 배열의 자기 조립을 용이하게하고 마이크로 유체 장치에서 비 특정 흡착을 방지하기 위해 표면은 화학적으로 수정됩니다
2. 장치를 통해 구성 요소를 흘러하려면 장치의 유동 채널 중 하나 필요한 솔루션으로 새로운 튜브를 연결합니다. 수동 매니 폴드에 튜브의 무료 쪽을 연결하고 공기 압력 흐름 (5 PSI)을 엽니 다.
3. 장치를 통해 20 분을위한 그것의 약 절반 새로운 튜브 및 흐름에 Biotinylated-BSA (1 μg / μl) 40 μl를로드, BSA는 에폭시 표면에 바인딩됩니다.
4. 다른 표면 화학 각 단계 사이에 unreacted 기판 세척을위한 Hepes (50 MM)를 사용합니다.
5. biotinylated-BSA의 꼭대기에서 20 분에 흐름 25 μl Strepavidin (0.5 μg / μl).
6. 5 분에 Hepes을 씻으십시오.
7. '버튼'밸브를 닫고 biotinylated-BSA의 나머지 부분을 (descri으로 흘러버튼을 둘러싸고있는 표면을 부동화 위 침대).
8. 5 분에 Hepes을 씻으십시오.
9. 20 분에 펜타 - 그의 - 비오틴의 '버튼'밸브 및 유량 30 μl (0.16 μg / μl)를 놓습니다. 항체는 노출 strepavidin에 바인딩되며 특별히 안티 그의 태그 배열을 만드는 '버튼'아래의 지역.

5. 단백질 표현

1. 토끼 망상 적혈구 빠른 커플 링 전사 및 번역 반응을 사용하여 장치에서 단백질을 표현한다. 장치의 무늬 합성 유전자에서 단백질 표현은 사용할 준비가 단백질의 배열을 만듭니다. 예를 들어, 하나의 사용은 단백질 구속력 화면입니다.
2. '목'밸브 및 유량 토끼 망상 적혈구 빠른 커플 링 전사와 DNA 챔버에 장치를 통해 번역 반응을 엽니 다. 다음으로 '샌드위치'밸브를 닫고 그 환경에서 각각의 유전자를 분리합니다. 30에 2.5 시간을위한 핫 플레이트에 장치를 품다 ° C. 표현 PRoteins는 C-말단 태그를 통해 단백질을 immobilizing '버튼을'밸브 아래에있는 반 그 항체에 DNA 챔버에서 반응 챔버 저절로 (목 밸브가 열려있는)과 바인드로 확산됩니다.
3. C-myc Cy3 항체와 단백질을 붙입니다. 항체는 단백질 N-말단에 위치한 해당 에피토프에 바인딩됩니다.
4. 532 nm의 레이저와 575 nm의 방출 필터를 사용하여 microarray 스캐너 (LS가 다시로드, Tecan)와 단백질 표현 수준을 결정합니다.

6. 대표 결과

1. 장치 제작

장치에 대한 그래픽 디자인은 우리의 실험 필요에 따라 AutoCAD를에 의해 만들어졌습니다. 디자인은 고해상도 이미지 세터에 의해 투명 필름에 인쇄되었습니다. 이 투명성 연락처 석판 술의 photomask 역할을합니다. 표면 micromachining 기술은 t에 새겨 져있는 패턴에 의해 결정 실리콘 웨이퍼에 3-D 템플릿을 생성하는 데 사용 된그는 마스크가 사용됩니다.

마이크로 유체 장치는 실리콘 탄성체 polydimethylsiloxane (PDMS, SYLGARD 184, 다우 코닝, USA) (그림 1) 주조 실리콘 몰드에 가공했습니다. 각 장치는 2 개의 정렬 된 PDMS 층, 흐름과 제어 계층으로 구성되어 있습니다. 곰팡이가 처음 베이킹 단계 이후 엘라스토머 자료를 홍보하기 위해 10 분 동안 chlorotrimethylsilane (TMCS, 올드리치) 증기에 노출되었다. 실리콘 기반의 탄성과 경화 에이전트의 혼합물은 두 개의 서로 다른 비율 각각 5시 1분과 제어 및 흐름 금형에 대한 20시 1분에 준비되었습니다. 제어 계층은 80 ° C.에 degassed 30 분 동안 구운되었습니다 흐름 층은 처음 60 초에 2,600 rpm으로 (Laurell, USA) 코팅 돌리고 ° C 30 분에 80에서 구운되었습니다. 제어 계층은 그 곰팡이에서 분리되었으며, 제어 채널 액세스 구멍 천공되었습니다. 다음으로 흐름과 제어 층은 입체경에서 수동 정렬 80에서 2 시간에 구운 된 ° C. 두 레이어 장치는 F를 벗겨되었습니다ROM은 흐름 금형 및 유동 채널 액세스 구멍 천공되었습니다.

2. 장치 설명

장치 용량은 500에서 10,000 단위 세포 (그림 2)로 다양 할 수 있습니다. 이 장치는 두 레이어로 구성되어, 흐름 층 (회색)과 제어 계층 (컬러). 제어 계층은 서로 다른 기능을 밸브의 다양한 포함되어 있습니다. 흐름 층의 각 단위 세포는 하나의 DNA 한 반응 챔버로 구성되어 있으며 micromechanical 밸브의 세 가지 유형에 의해 제어됩니다, '목', '버튼'및 '샌드위치'(그림 2A). DNA 챔버 내에서 증착 무늬 '합성 유전자'는 '목'밸브 (녹색)에 의해 반응 챔버로부터 차단됩니다. 반응 챔버의 표면에 바인딩 단백질의 트래핑 및 기계적 세척는 '버튼'밸브 (파란색)에 의해 수행됩니다. '샌드위치'밸브는 자체 단위 세포 (빨간색)에서 발생하는 각 반응을 할 수 있습니다. 주소 밸브는 differe에 대해, 8 독립적 인 섹션에 장치를 분할 할 수 있습니다NT 상태 분석. 또한, 제어 계층은 흐름 층에 선택된 유체의 흐름을 활성화 입력 밸브가 포함되어 있습니다. PDMS 제어 채널은 DDW로 가득 찼습니다. PDMS의 확대에 밸브가 압력 증가를 구동합니다 (15 PSI) 결과입니다. 막이 충분히 얇은 곳에서 (즉, 제어 및 흐름 라인의 교차점)이 완전히 흐름 라인을 차단하기에 충분합니다. 평균 단위 세포의 높이가 10 μm이며, 평균 단위 세포 볼륨 미만 NL입니다.

3. 단백질 표현 및 검색

단백질은 토끼 망상 적혈구 빠른 커플 링 전사 및 번역 반응 (Promega)를 사용하여 장치에 표현했다. 단백질의 표현은 구속력이 화면에서 사용할 준비가 단백질 (그림 3)의 배열을 만들었습니다. 표현 믹스 (12.5 μl)이 장치에로드 한 후 '목'밸브를 열어 DNA 챔버로 침수되었습니다. 다음으로 '샌드위치'밸브였다그 주변 세포와 장치에서 분리 각 단위 세포가 30에서 2.5 시간에 대한 뜨거운 접시에 incubated되었습니다 떠나는 ° C. 폐쇄 자신의 C-말단 그의 태그는 반 그의 항체 (Qiagen)은 표면에 단백질을 immobilizing '버튼을'밸브에서 지역화 구속 수있는 반응 챔버로 유전자 챔버를 통해 확산 표현 단백질. 단백질은 단백질 N-말단에 위치한 해당 에피토프에 바인딩하여 표시 C-myc Cy3 (시그마)로 표시했다. 단백질의 발현 수준은 532 nm의 레이저와 575 nm의 필터를 사용하여 microarray 스캐너 (LS가 다시로드, Tecan)로 결정됩니다. 그 결과 단백질 배열은 단백질 표현의 수준을 다양한 구성되어 있습니다. 일반적으로 유전자 라이브러리의 약 20 %가 감지 수준으로 표현하는 실패합니다. 단백질 크기가 상관 관계 ^3을 관찰 없습니다. 배경 수준은 DNA를 발견되지 않은 방을 사용하여 결정됩니다. 따라서, 해당 단백질 챔버에서 신호는 N 중로 인해우아즈 또는 라벨 항체의 비 특정 흡착.

1 그림. 칩 제조. (A) 사상균은 10 분에 TMCS 증기로 치료했다. (B) PDMS는 제어 및 흐름 실리콘 금형에 주조되어 있습니다. (C) 모두 제어 및 흐름 금형는 80 ° C 30 분에 구운 있습니다. (D) 형의 껍질을 벗겨 제어 계층은 크기로 절단 및 제어 유입구가 천공되어 있습니다. (E) 제어 층 입체경 아래 유동 레이어에 정렬 한 후 80에서 구운되어 2 시간에 ° C.주세요 PDMS 장치 제조에 평행으로 합성 유전자의 시리즈는 에폭시 코팅 유리 기판 (CEL 제휴)에 microarrayed 있습니다. (F) 장치는 다음 DNA 챔버 내에서 '합성 유전자'를 막고 DNA의 microarray으로 정렬되어 있습니다.

그림 2. PING 장치의 사진입니다. (A) 장치 consi2 개의 정렬 된 PDMS 층 (제어 및 흐름)의 ST. 흐름 층은 컨트롤 레이어에 micromechanical 밸브 ( "버튼", "샌드위치"와 "목")에 의해 제어 병렬 DNA와 반응 챔버 (회색)가 포함되어 있습니다. (B) 레이어가 인쇄 된 microarray, 단일 지점 각 DNA 챔버 프로그램에 정렬된다. 이 잠재적 인 오염을 제거합니다.

그림 3. 마이크로 유체 칩으로 만든 단백질 배열의 형광 이미지. 인쇄 현장 유전자는 장치 내의 단백질 (DNA 챔버)로 표현 된 그들의 통해 (반응 챔버의 "버튼"밸브 아래) 표면에 내려 오게되었습니다 C-말단 그의 태그입니다. 단백질 표현들은 C-myc N-말단 태그와 특정 형광 항체를 사용하여 감지되었습니다. 다른 신호 강도는 다른 단백질 표현 수준을 나타냅니다. 취소 제의 방 배경 르에 대한 컨트롤로 제공vels.

토론

이 논문에서 우리는 마이크로 유체 플랫폼을 사용 높은 처리량의 생성 단백질 배열을위한 방법을 제시한다. 배열 생성은 DNA 템플릿 microarray 인쇄와 마이크로 유체 장치 내의 DNA에서 체외 단백질 발현에 기반을두고 있습니다.

우리 소설 마이크로 유체 플랫폼은 단백질 체학을위한 유망 및 일반 툴을 만들 현재 사용 방법을 통해 몇 가지 중요한 장점을 가지고 있습니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 장비	회사	카탈로그 번호
PDMS-SYLGARD 184	다우 코닝 USA	섹스-DC
Chlorotrimethylsilane (TMCS	시그마 - 알드리치	C72854
에폭시 코팅 유리 기판	CEL 제휴 USA	VEPO-25C
폴리 에틸렌 glycole (PEG)	시그마 - 알드리치	81,260
D-trehalose 이수화	시그마 - 알드리치	T9531
Biotinylated-BSA	찌르다	PIR-29130
Neutravidin	찌르다	31,050
펜타 - 그의 - 비오틴	Qiagen	34,440
Hepes	생물 산업	03-025 - 1B
TNT-T7	Promega	L5540
C-myc Cy3 항체	시그마 - 알드리치
컨트롤 박스	스탠포드 Microfluidics 주조
곰팡이	스탠포드 Microfluidics 주조
핀	뉴 잉글랜드 작은 튜브 주식회사
Tygon microbore 관	Tygon	S-54-HL
Microarrayer	바이오 로봇	MicroGrid 610
실리콘 핀	병렬 SYN명제	SMT-S75